细胞膜通透性对大黄欧文氏菌异麦芽酮糖产率的影响

李晓亚，吴甜甜，王洪玲，葛文沛，刘娜

（河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450001）

近年来，低热量、低糖食品逐渐成为消费趋势。摄入的糖分过高会在体内转化为脂肪，导致发胖，甚至引起高血脂、高血压、糖尿病等疾病。因此，肥胖、糖尿病和龋齿等问题使消费者对蔗糖替代品的需求升高。有研究表明，低糖、低热量的饮食方式不仅能改善高血脂症状，降低机体患糖尿病、心血管疾病的风险[1]，还有助于维持长时间的饱腹感和持续的能量释放，从而进一步对身体和精神状况产生积极影响，这使功能性甜味剂得到广泛关注[2]。异麦芽酮糖（6-O-α-D-吡喃葡糖基-D-呋喃果糖）又名帕拉金糖，是蔗糖的一种同分异构体，1957年由威登·哈根和洛伦兹首次发现[3-4]，除具有与蔗糖类似的物理性质和口感外，还有低热量、不致龋、不吸湿、耐酸解的特点[5]，其甜度约为蔗糖的50%，适合作为蔗糖的替代品[6]。已有国家将异麦芽酮糖认证为公认安全级食品[7]，可防止脂肪过量积累[8]，食用后不会引起血糖与胰岛素的迅速上升，有助于糖尿病的防治[9-10]。异麦芽酮糖作为功能型甜味剂，越来越广泛地应用于食品与医疗行业。

异麦芽酮糖天然存在于甜菜、糖蜜和糖浆等食物中，但其含量微乎其微，提取困难，无法满足市场的需求[11]。目前，异麦芽酮糖的主要来源是以微生物转化法为主。大黄欧文氏菌（Erwiniarhubarb）DXW-62 中的蔗糖异构酶（α-葡糖基转移酶，sucrose isomerase，简称SIase，EC 5.4.99.11）可以将蔗糖异构为异麦芽酮糖，但该酶为胞内酶[8，12]。改变DXW-62 的细胞膜通透性有利于蔗糖与蔗糖异构酶的接触，从而提高蔗糖异构酶的催化效率。超声波可以提高细胞膜的通透性，经超声波作用后的细胞膜对钾和钙离子的通透性会发生较大的改变[13]。从而增强生物膜的弥散性，促进物质交换，加速代谢，改善组织营养。吐温-80 是一种亲水性的表面活性剂，具有很强的破坏细胞膜的作用，也是一种油/水型乳化剂，可用作稳定剂、扩散剂、抗静电剂、纤维润滑剂等[14]。丙酮和甲苯可使细胞膜的磷脂结构受到破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释放到胞外。因此，本研究利用超声波、吐温-80、丙酮和甲苯等处理方法改变大黄欧文氏菌DXW-62 细胞膜通透性，加快蔗糖异构酶的催化效率，进而提高异麦芽酮糖产率，以期为异麦芽酮糖的工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种及培养基

大黄欧文氏菌DXW-62：河南工业大学生物工程学院实验室保存。

固体培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂15 g/L。

种子培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，蔗糖40 g/L。

液体培养基[15]：蛋白胨5 g/L，牛肉膏3 g/L，磷酸氢二钠3 g/L，蔗糖80 g/L。

以上培养基均在115 ℃，30 min 条件下进行灭菌处理。

1.2 主要试剂

异麦芽酮糖标准品：北京沃凯生物科技有限公司；吐温-80：天津市光复精细化工研究所；乙腈（色谱级）、丙酮、甲苯、磷酸二氢钠、柠檬酸（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、碘化丙啶（100 μg/mL）：武汉塞维尔生物科技有限公司；蔗糖、氯化钠（均为分析纯）、蛋白胨（生物试剂）、牛肉膏（生物试剂）、琼脂（生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.3 主要仪器与设备

BXM-30R 立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；KYC-100B 恒温培养摇床：上海新苗医疗器械制造有限公司；LC-2030C 高效液相色谱仪（检测器为示差折光检测器）：日本岛津公司；HWQ-280 恒温培养箱：宁波市科技园区新江南仪器有限公司；DZKW-S-4 电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；UV-3100PC 紫外可见分光光度计：上海美普达仪器有限公司；Revolve FL 荧光显微镜：美国Echo Laboratories 公司。

1.4 方法

1.4.1 菌株发酵液中生长曲线的建立

比浊法测菌液OD600：将种子培养基按5%的接种量接于发酵培养基，6.0～16.0 h 定时取样，每次取样取3 个平行。加入10 mL 浓度为70%蔗糖溶液中，混匀并在40 ℃、180 r/min 摇床中反应2.0 h，分别以培养时间为横坐标，OD600和异麦芽酮糖产率为纵坐标，绘制菌株生长曲线[16]。

1.4.2 异麦芽酮糖标准曲线的绘制

将异麦芽酮糖配制成0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL 的标准液，过0.22 μm 的水系滤膜，通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定其峰面积，通过各浓度对应的峰面积绘制标准曲线[17]。检测条件：ZORBAX 碳水化合物分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈∶水=80∶20（体积比），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL，运行时间20 min。

1.4.3 细胞膜的通透性处理

将大黄欧文氏菌DXW-62 接种到固体培养基中过夜，取DXW-62 接种于种子培养基中，30 ℃，180 r/min中振荡反应10.0 h 至对数期（OD600为0.60±0.05）。按5% 的接种量接入100 mL 液体培养基，反应10.0 h 得到发酵液。

超声波处理：将上述发酵液继续反应2.0 h 后置于冰水浴中进行超声波处理。超声波的作用参数：变幅杆6，频率25 kHz，功率分别为45、90、135、180、225、270 W，时间1 min。取超声波处理后的发酵液于4 ℃、9 000×g条件下离心10 min，收集菌体，用去离子水重悬清洗3 次，加入10 mL 浓度为70% 蔗糖溶液中，混匀并在40 ℃、180 r/min 摇床中反应，每隔0.5 h 取1 mL 发酵液于沸水浴5 min 灭酶以终止反应。反应结束后，以相同条件离心反应混合物，上清液稀释5 倍后经0.22 μm 滤膜过滤，采用HPLC 法测定异麦芽酮糖含量[18]，以未经超声波处理的发酵液为空白对照组。

吐温-80 处理：向发酵液中加入体积分数分别为0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%和6.0%的灭菌吐温-80 后继续反应2.0 h，后续测定异麦芽酮糖含量的操作同上。

丙酮或甲苯处理：向发酵液中分别加入丙酮和甲苯，丙酮或甲苯在发酵液中的体积比分数分别为0.5%、1.0%、2.0%、3.0% 和4.0%，继续反应2.0 h，后续测定异麦芽酮糖含量的操作同上。

超声波和吐温-80 共同处理：以90 W 超声波和体积分数为5.0% 的吐温-80 共同处理DXW-62，后续测定异麦芽酮糖含量的操作同上。异麦芽酮糖产率（y，%）的计算公式如下。

y=a/b× 100

式中：a为测得的反应体系中异麦芽酮糖含量，g；b为反应体系蔗糖质量，g。

1.4.4 细胞膜通透性的测定

检测细胞膜通透性的方法用碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色法[19-20]。取1 mL 菌液，在4 ℃、8 000×g条件下离心10 min 去上清液，用PBS 清洗2 次后放入孔板。将100 μg/mL 的PI 染液用PBS 稀释20 倍，配制成终浓度为5 μg/mL 的PI 染色工作液，向孔板内加入适量PI 染色液覆盖细胞，室温避光孵育10 min。孵育后弃去染色液，加入PBS 覆盖细胞，用荧光显微镜观察细胞是否呈现红色荧光。PI 不能穿透完整细胞膜，死细胞或凋亡晚期细胞的核呈红色荧光。

1.5 数据分析

所有测定均设计3 次平行。使用Origin 2021 软件对数据进行分析作图。

2 结果与分析

2.1 异麦芽酮糖标准曲线

根据0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL 异麦芽酮糖浓度和所对应的峰面积绘制标准曲线，如图1所示，线性方程为y=14 883x- 5 998.9，R2=0.999 4，相关性良好。

图1 异麦芽酮糖标准曲线Fig.1 Standard curve of isomaltulose

2.2 发酵液的菌体浓度及异麦芽酮糖产率

在6.0～16.0 h 内，定时取样检测菌体浓度和异麦芽酮糖产率，结果见图2。

图2 发酵液的菌体浓度及异麦芽酮糖产率Fig.2 Cell concentration and isomaltulose yield of fermentation broth

由图2 可知，在6.0～12.0 h 内，异麦芽酮糖产率和菌体浓度随培养时间的延长而上升，在12.0 h 时异麦芽酮糖产率已达到最高，为53.76%；超过12.0 h 后异麦芽酮糖产率逐渐下降，菌体浓度随着培养时间的延长增加缓慢。这说明随着培养时间的延长，菌株迅速繁殖，异麦芽酮糖产率逐渐上升，但是培养时间过长，培养基内的营养物质被大量消耗，菌体生长繁殖受限[15]，异麦芽酮糖产率下降，在培养16.0 h 时异麦芽酮糖产率下降至45.23%。

由于吐温-80、丙酮和甲苯是有机试剂，需要与菌体接触反应2.0 h 才能测定异麦芽酮糖产率。综上所述，在培养12.0 h 时异麦芽酮糖产率最高，使用超声波处理菌体；在培养10.0 h 时，菌株生长速度最快，分别添加吐温-80、丙酮和甲苯到培养基中。

2.3 不同超声功率对异麦芽酮糖产率的影响

不同超声功率对异麦芽酮糖产率的影响见图3。

图3 不同超声功率对异麦芽酮糖产率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic waves with different power on isomaltolose yield

由图3 可知，与对照组相比，采用不同功率的超声波处理条件均可提高异麦芽酮糖产率。当时间为2.0 h，对照组的异麦芽酮糖产率为54.47%，同时超声功率为45 W 时，异麦芽酮糖产率为65.03%；超声功率为90 W 时，异麦芽酮糖产率为72.30%。超声功率为270 W 时，异麦芽酮糖产率为61.07%，比对照组高12.12%。这是由于低功率超声波可以使细胞短时局部破裂，改变细胞膜的通透性，使胞内物质释放或胞外物质进入细胞内，从而使异麦芽酮糖产率上升。但是随着超声功率的增大，对细胞破坏程度加大，使胞内物质释放导致细胞失活，戴传云等[21]也验证了低功率超声波可以导致细胞的非热生物效应，使细胞表面瞬间造成微伤，改变细胞膜通透性，从而使代谢产物或营养物质快速通过细胞膜，提高代谢产物的产率。

因此，最佳的处理条件为超声功率90 W，相对于对照组，异麦芽酮糖产率达到80.0% 以上的时间由4.0 h 缩短为3.0 h。

2.4 吐温-80 对异麦芽酮糖产率的影响

不同浓度的吐温-80 对异麦芽酮糖产率的影响见图4。

图4 不同浓度的吐温-80 对异麦芽酮糖产率的影响Fig.4 Effect of tween-80 with different concentrations on isomaltolose yield

由图4 可知，只有浓度为6.0%的吐温-80 处理过后，异麦芽酮糖产率低于对照组。当时间为2.5 h 时，对照组的异麦芽酮糖产率为60.53%；浓度为2.0% 的吐温-80 反应2.5 h 时异麦芽酮糖的产率为63.65%，与对照组相比高5.15%；浓度为5.0% 的吐温-80 反应2.5 h 时异麦芽酮糖的产率为83.14%，与对照组相比高37.35%；浓度为6.0%的吐温-80 反应2.5 h 时，异麦芽酮糖产率低于对照组，只有60.29%。可以合理推测低浓度的吐温-80 对细胞产酶有明显的促进作用，浓度过高时对细胞产酶有明显的抑制作用。原因是吐温-80为非离子型表面活性剂，可以将脂类溶解来改变细胞膜通透性[22]，能够有效提高异麦芽酮糖产率。综上，选用浓度为5.0%的吐温-80 作为处理条件。

2.5 丙酮对异麦芽酮糖产率的影响

不同浓度的丙酮对异麦芽酮糖产率的影响见图5。

图5 不同浓度的丙酮对异麦芽酮糖产率的影响Fig.5 Effect of acetone with different concentrations on isomaltolose yield

如图5所示，所有浓度的丙酮处理均可使大黄欧文氏菌DXW-62 的异麦芽酮糖产率提高。当时间为3.5 h 时，对照组的异麦芽酮糖产率为76.90%；添加浓度为0.5% 的丙酮反应3.5 h 时异麦芽酮糖产率为81.01%，比对照组高5.34%。添加浓度为2.0%的丙酮反应3.5 h 时异麦芽酮糖产率为83.04%，比对照组高7.98%。添加浓度为4.0%的丙酮反应3.5 h 时异麦芽酮糖产率为81.02%，比对照组高5.36%。这是由于丙酮可以破坏脂质双层结构，使细胞内物质暴露在外部环境中，所以添加少量的丙酮可以增大细胞膜通透性[23]，提高异麦芽酮糖产率。但是与功率为90 W 超声波和添加浓度为5.0% 的吐温-80 处理相比，浓度为2.0%的丙酮对异麦芽酮糖产率提高较少。综上，应用浓度为2.0%的丙酮处理大黄欧文氏菌DXW-62。

2.6 甲苯对异麦芽酮糖产率的影响

不同浓度的甲苯对异麦芽酮糖产率的影响见图6。

图6 不同浓度的甲苯对异麦芽酮糖产率的影响Fig.6 Effect of toluene with different concentrations on isomaltulose yield

由图6 可知，不同浓度的甲苯对异麦芽酮糖产率有很大影响。在3.5 h 时对照组的异麦芽酮糖产率为76.90%；添加浓度为0.5% 的甲苯反应3.5 h 时，异麦芽酮糖产率为77.44%；添加浓度为1.0% 的甲苯反应3.5 h 时，异麦芽酮糖产率为77.52%；添加浓度为2.0%的甲苯反应3.5 h 时，异麦芽酮糖产率为72.41%，此时产率已经比对照组低，继续用浓度为3.0%和4.0%甲苯处理，异麦芽酮糖产率相比于对照组越来越低。由此可知低浓度甲苯处理对菌体细胞影响较小，能够小幅度提高异麦芽酮糖产率，而高浓度甲苯能够溶解大黄欧文氏菌DXW-62 细胞膜，导致细胞膜破损使细胞失活，所以异麦芽酮糖产率下降，刘晓艳等[14]的研究也表明了甲苯对细胞膜的损伤较大。综上所述，添加浓度为1.0%的甲苯作为处理条件最佳。

2.7 超声波与吐温-80 共同处理对异麦芽酮糖产率的影响

90 W 功率的超声波和浓度为5.0% 的吐温-80 共同处理大黄欧文氏菌DXW-62，结果如图7所示。

图7 超声波和吐温-80 共同作用对异麦芽酮糖产率的影响Fig.7 Effect of ultrasound wave and tween-80 on isomaltulose yield

图7 结果表明，经过超声波与吐温-80 的共同作用后，并未提高异麦芽酮糖产率，产率最大为63.75%，此时对照组麦芽酮糖产率为82.99%，试验组与对照组相比低23.18%。这是因为采用超声波和吐温-80 共同处理对细胞的破碎程度更大，导致细胞失活。经过超声波和吐温-80 共同处理后的细胞破损程度太大，从而使细胞失活，导致异麦芽酮糖产率降低。

2.8 经PI 染色法后的荧光显微镜观察结果

PI 染色结果如图8所示。

图8 PI 染色法的荧光显微镜观察结果Fig.8 Observation results of fluorescence microscope by PI staining method

由图8 可知，对照组极少细胞被PI 染色；浓度为5.0% 的吐温-80 处理后细胞显红色荧光细胞数量比90 W 功率超声波处理后的数量多；然后吐温-80 和超声波共同作用下，显红色荧光细胞数量明显多于其余单因素处理。

显红色荧光细胞数量越多，细胞膜通透性越强[24]。试验结果表明细胞膜通透性在一定程度上可以提高异麦芽酮糖产率，但是如果细胞膜通透性越大，那么细胞破碎就越多，这样反而会使异麦芽酮糖产率下降。

3 结论

本文通过研究不同的处理方法对大黄欧文氏菌DXW-62 的细胞膜通透性的改变，探究其对异麦芽酮糖产率的影响。结果表明，使用功率为90 W 的超声波处理后，反应2.0 h 时和其他功率的超声波相比，异麦芽酮糖产率最高为72.30%，高于对照组（54.47%）；利用浓度为5.0% 的吐温-80 处理，继续反应2.5 h 后异麦芽酮糖产率相比其他浓度的吐温-80 最高，为83.14%；在超声波和吐温-80 共同处理下，比对照组的异麦芽酮糖产率下降了23.18%，通过碘化丙啶染色观察可知显红色荧光细胞数量最多。