益气活血通络汤与低分子肝素抗凝对大鼠骨折愈合、血液流变学及TGF-β1表达的影响

李启义 张江涛 常守亚

(河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院),河南 洛阳 471000)

骨折裂性病变,通常是由于外力作用或内部病理因素导致〔1〕。据统计,我国每年有近千万人因不同原因发生骨折,其中骨折延迟愈合或不愈合情况是影响骨折患者功能康复的主要因素〔2〕。血液流变学对维持正常的血液循环和组织灌注具有重要意义,研究发现在骨折愈合过程中,血液流变学因素的改变可能会影响血液流动和组织的营养供应,从而影响骨折愈合的速度和质量〔3〕。近年来研究发现,多种生长因子在创口愈合、骨折愈合过程中起重要作用,如转化生长因子(TGF)-β1,其在细胞增殖及分化方面扮演着重要角色,同时对骨折修复的启动、调控、发育及塑形均有重要作用〔4〕。目前临床上治疗骨折除西医治疗外,中医治疗也是常用方法,且近年来随着现代医学的不断发展,中医治疗也在不断更新和发展,其在临床上取得了良好的效果,因此中药加速骨折愈合方面已经成为当今医学领域的研究热点〔5〕。益气活血通络汤是中医传统制剂,主要以黄芪、党参为君药,以当归、丹参、川芎为臣药,在诸药的共同作用下,共奏活血化瘀、益气固表、舒经活络、祛风培正、调和气血之功效,故其对骨折愈合当有奇效〔6〕。而低分子肝素Ⅲ主要治疗预防血栓性栓塞性疾病,但有研究表明其与中药联用,抗凝、抗血栓、扩张血管及增加血流等作用会形成叠加,对骨折形成的深静脉具有显著疗效,且不易并发出血〔7〕。本文探讨益气活血通络汤与低分子肝素抗凝对大鼠骨折愈合、血液流变学及TGF-β1表达的影响。

1 材料与方法

1.1动物材料 选取温州清江生物科技有限公司提供的60只SPF级SD雄性大鼠〔合格证书为:SCXK(浙)2019-0037〕,体质量205～255 g,饲养条件:23～26 ℃,相对湿度44%～73%,噪音<85 dB,提供充足日常饮水和食物,按照《实验动物管理条例》规定进行实验。

1.2实验材料 克氏针(货号:02jh2,新乡市金环有限公司);骨钳(货号:guj,南京卡尔文有限公司);益气活血通络汤(由本院中医部自制);低分子肝素钙(货号:国药准字H20060191,深圳赛保尔有限公司);苏木素染液(货号:RT-S004,北京兴怡雅创有限公司);伊红染液(货号:E301879-500ml,上海阿拉丁股份有限公司);光学显微镜(型号:CX23,美国奥林巴斯公司);全自动血流变分析仪(型号:HT-100B,潍坊嘉松有限公司);免疫组化试剂盒(货号:R200826,上海瑞楚有限公司);二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(货号:R110010,上海瑞楚有限公司);TGF-β1抗体(货号:YS-0086R,上海雅吉有限公司)。

1.3建模 随机选取50只大鼠,麻醉后将其仰卧位固定,然后暴露胫骨骨干,用骨钳截断形成骨折模型,将2 mm克氏针逆行向上打入胫骨上端,穿出皮肤后钳断克氏针尾,再顺行打入胫骨干,固定好后活力碘冲洗,在骨折周围滴入3滴庆大霉素,缝合伤口,术毕肌注青霉素7万U,连续3 d,建模中死亡5只,其余全部建模成功。

1.4分组及给药 从建模成功的大鼠中随机选取40只,将其分模型(B)组、益气活血通络汤(C)组、低分子肝素(D)组、益气活血通络汤联合低分子肝素(E)组,每组10只,同时随机选取10只正常大鼠作为正常对照(A)组,C组4 g/kg益气活血通络汤灌胃,D组500 U/kg低分子肝素灌胃,E组给予益气活血通络汤联合低分子肝素治疗,均1次/d,持续28 d,A、B组同期给予同体积生理盐水。

1.5X线摄片检测大鼠骨折愈合情况 实验完成后,给予大鼠腹腔注射0.5%的戊巴比妥钠进行麻醉,将其固定好后,对患肢行X线摄片检查,检查电压为60 V,电流为1.2 mA,距离为90 cm,以此观察大鼠骨折愈合情况。

1.6标本采集 各组在X线摄片拍摄完成后,腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉处死大鼠,从下腔静脉取血,加入抗凝剂后密封保存于冰箱中,同时游离出胫骨,洗净后,加入脱钙液进行脱钙处理,处理完成后用梯度乙醇脱水,二甲苯透明2次后常规石蜡包埋、切片,脱蜡后用4%多聚甲醛固定10 d,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后放入冰箱中密封保存。

1.7苏木素-伊红(HE)印迹检测大鼠骨组织病理形态 取部分胫骨组织,经二甲苯脱蜡→梯度乙醇水化→蒸馏水洗涤→苏木素染色5 min→伊红染液染色2 min→脱水→透明→中性树胶封片后,用光学显微镜进行组织病理学观察,然后应用IPP医学图像处理系统,计算软骨、骨性骨痂、纤维性骨痂在骨痂总面积的比例,以反映骨折愈合情况。

1.8血液流变学指标的测定 取各组静脉血,全自动血流变分析仪检测全血低切黏度、中切黏度、高切黏度及血浆黏度,检测于 25 ℃条件下进行,由专人操作,且需严格按照仪器说明书进行操作。

1.9免疫组化法检测骨组织中TGF-β1蛋白表达 取各组胫骨组织,使用抗原修复液(10 mmol/L Tris-EDTA缓冲液,pH9.0)用微波方式对组织切片进行抗原修复,用5%～10%的普通血清(牛血清)对组织切片进行蛋白质阻断,然后进行一抗孵育、二抗孵育,在每个孵育步骤之后,使用Tris缓冲液轻轻地洗涤组织切片,以去除非特异性结合的抗体,然后用DAB进行显色,脱水、透明、封片后,光学显微镜观察,并应用计算机病理图像处理系统对 TGF-β1的阳性表达进行定量分析,用积分吸光度值来展示统计结果。

1.10统计学分析 采用GraphPad Prism8.0软件进行t、χ2检验,方差分析。

2 结 果

2.1各组胫骨骨折X线摄片结果 与A组相比,B组骨折线清晰,且没有形成明显骨痂;与B组相比,C、D、E组骨愈合速度明显加快;C、D组骨折线仍可见但折断端边缘趋于模糊,且形成明显骨痂;而E组骨折基本消失,髓腔再通,外骨痂减少,可见大部分骨痂长入骨折线,已有骨外膜形成并可见骨连接形成,见图1。

图1 各组胫骨骨折X线摄片

2.2各组HE染色结果 A组骨组织形态完整,骨小梁生长旺盛,排列规则有序,且无坏死区域;B组骨组织形态紊乱,出现部分坏死区域,并可见少量纤维组织;C、D组骨痂组织中可见大量肉芽组织、纤维组织长入,成软骨细胞增生活跃,并有网状交织的骨小梁;E组骨组织形态已趋于完整,排列有序且部分已被正常组织替代,骨小梁排列相对规则,可见部分成熟板状骨形成,见图2。

图2 各组胫骨组织(HE染色,×100)

2.3各组胫骨组织TGF-β1蛋白表达 5组胫骨组织TGF-β1蛋白表达差异有统计学意义(F=18.000,P<0.001)。与A组(2.13±0.12)比较,B组胫骨组织TGF-β1蛋白表达显著降低(0.98±0.08,P<0.05);与B组比较,C、D、E组胫骨组织TGF-β1蛋白表达显著升高(1.54±0.11、1.53±0.12、2.14±0.12,P<0.05);与C、D组相比,E组上述指标显著升高(P<0.05),见图3。

图3 各组胫骨组织TGF-β1蛋白表达(免疫组化,×400)

2.4各组骨折愈合相关指标结果 与A组比较,B、C、D、E组软骨比例显著降低,纤维骨痂比例显著升高(均P<0.05);与B组比较,C、D、E组软骨比例显著升高,纤维骨痂比例显著降低(P<0.05);与C、D组相比,E组软骨比例显著升高,纤维性骨痂比例明显降低(P<0.05),而各组骨性骨痂比例相比无明显差异(P>0.05),见表1。

2.5各组血液流变学相关指标结果 与A组比较,B、C、D、E组全血低切黏度、中切黏度、高切黏度及血浆黏度显著升高(P<0.05);与B组比较,C、D、E组血低切黏度、中切黏度、高切黏度及血浆黏度显著降低(P<0.05);与C、D组相比,E组上述指标降低显著(P<0.05),见表1。

表1 各组骨折愈合、血液流变学相关指标

3 讨 论

在临床上,一般通过治疗多数患者骨折都会到达愈合,但骨折愈合是一个复杂且相对漫长的生物学过程,其会受到如缺血、感染、年龄和健康状况等多方面因素的影响 ,因此骨折延迟愈合及不愈合的情况也时有发生,这不仅使得患者的行动及生活受限极大,还对患者及其家属造成了一定负担〔8〕。

本研究发现,益气活血通络汤与低分子肝素均具有显著疗效,可显著促进骨折愈合,改善大鼠骨组织形态,且联合效果更佳。低分子肝素是治疗及预防深静脉血栓的重要药物,是由肝素裂解、纯化后得到的低分子量肝素组成的混合物,具有明显的抗凝血因子Xa活性,可有效抑制体内外血栓和动静脉血栓的形成〔9〕。而益气活血通络汤则充分体现了中医的两大特点之一“整体观念”,并运用“益气活血舒筋活络”为治则,从而达到标本兼治,局部与全身兼顾,祛邪与扶正兼施的目的〔10〕。在中医中,骨折被称为“骨碎”或“骨折”,中医认为骨折是由于外伤引起的气血瘀滞、经络阻塞等问题导致,因此在中医治疗骨折时,主要是通过活血化瘀、通络舒筋以及调和气血等方法来促进骨折的愈合〔11〕。近年来虽然随着医学的不断发展,骨折愈合率越来越高,但骨折愈合时间仍然较长,大多数骨折仍需6～12 w才能达到临床愈合,此外还时有骨折愈合延迟或不愈合的情况,有调查显示这种情况可占骨折的10%左右,是影响骨折病人功能康复的重要问题,已经广泛受到医学领域的关注〔12〕。而对于骨折大鼠,益气活血通络汤联合低分子肝素可能是通过活血通络、抗凝、抗血小板聚集的作用,来改善血液循环,从而增强新陈代谢、促进基质胶原的合成、提高成骨细胞的活性、增强机体清除血肿的能力等,进而促进骨痂形成、并有效促进骨形成及骨重建,最终到达加速骨折愈合的目的。周志豪〔13〕研究表明,养血固肾汤具有显著疗效,可显著促进钙盐沉积、增强体内成骨细胞的活动、进而促进骨折大鼠骨折愈合,改善其病理形态,这与本文结果类似。

本研究表明,益气活血通络汤与低分子肝素可显著改善骨折大鼠血液流变学,且联合效果更佳。在骨折初期,受伤组织会发生出血,形成血肿,而血肿的形成会导致骨折处血液的供应情况变差,从而直接影响新骨的生成,因此,良好的血供是促使骨折愈合的首要条件〔14〕。而血液流变学是研究血液在血管内流动时的性质和特性的科学领域,也是判断血瘀程度的客观指标,故检测其变化可有效明确机体血液循环及血瘀情况〔15〕。而对于骨折大鼠,益气活血通络汤联合低分子肝素可能是通过促进全身气血循环,来加强血液循环及离子的运转,从而加速代谢、提高肢体血流量、改善缺血、缺氧、乳酸蓄积情况,进而改善骨折处的血液供应、降低血液黏稠度、提高骨痂的生物力学性能、刺激骨生长因子的分泌与合成等,最终加快骨吸收愈合,改善骨生物力学。李书良〔16〕研究发现,益气活血通络汤联合低分子肝素钙对老年股骨转子间骨折具有显著疗效,可有效降低骨折术后下肢深静脉血栓的发生率,且无不良反应,这与本文结果类似。

本研究说明,益气活血通络汤与低分子肝素可显著促进TGF-β1表达,且联合效果更佳。TGF-β1与许多病理、生理的发生发展过程都有着密切联系,有研究表明,其是成纤维细胞、成骨细胞的促有丝分裂原,可促进细胞增殖、分化和基质蛋白的合成,同时具有刺激骨膜内骨形成的作用,因此,研究其表达情况可作为阐明骨折愈合分子机制的重要步骤〔17～19〕。而对于骨折大鼠,益气活血通络汤联合低分子肝素可能是通过活血化瘀、通经活络、去瘀生新等功效,来加速毛细血管的形成,从而促进血液运行、刺激降钙素基因相关肽等神经肽类物质的释放、刺激骨细胞增殖分化、刺激成骨细胞活性等,进而促进TGF-β1表达、达到促进骨蛋白的合成、增加骨基质等的目的,最终有效提高骨折愈合程度。郇义超等〔20〕研究发现,益气健骨补肾方可显著改善股骨骨折大鼠骨转化指标,提升骨生物力学性能,促进TGF-β1表达,这与本文结果类似。

综上,益气活血通络汤联合低分子肝素抗凝具有显著疗效,其可显著促进骨折愈合,改善血液流变学,并促进TGF-β1表达。