基于Nrf2/HO-1信号通路研究下调miR-29对慢性心律失常大鼠的干预作用

郑丽玮 黄晶 雷玉华 华晓芳 朱贤林 周慧

(恩施土家族自治州中心医院内科心血管病中心,湖北 恩施 445000)

心律失常主要是因窦房结异常激动或是激动于窦房结产生外,激动的传导较慢、受阻或通过通道异常传导,即心脏活动的起源或传导异常致使心脏搏动频率发生障碍〔1,2〕。临床主要表现为乏力、心慌、头晕、胸闷等,严重可危及患者的生命安全〔3〕。心律失常的治疗主要以减轻或消除症状,及时纠正心律失常导致出现的血流动力学异常为原则〔4,5〕。临床上最常用的治疗手段主要以抗心律失偿药物为主,但治疗过程中存在较多药物禁忌,疗效欠佳,而近年来由于该病的患病率在国内不断上升,引起了较多学者的重视〔6〕。微小RNA(miR)在该病发展时起到了一定作用,目前经研究可证实miR-29可能是与慢性心律失常有关联的mRNA,但miR-29与慢性心律失常的有关研究相对较少〔7〕。基于此,本文分析下调miR-29对于慢性心律失常模型大鼠的影响,并与核因子E2相关因子(Nrf)2/血红素氧合酶(HO)-1信号通路有关,以期为临床干预该病提供有效依据。

1 材料与方法

1.1动物与试剂 选取40只SD雄性健康大鼠,由河南省疾病预防控制中心提供,动物许可证号:SYXK(豫)2017-0009,体质量256～280 g,平均(268.11±9.54)g,7～10周龄,平均(8.6±1.2)周龄,于24 ℃室温中喂养所有大鼠。本试验均严格按动物实验标准进行操作,且取得本院委员会批准。主要试剂:兔抗大鼠N端B型钠尿肽前体(NT-proBNP)抗体(武汉维克赛思科技有限公司,批号AB10151);小鼠抗兔Nrf2、HO-1抗体(武汉益普生物科技有限公司、上海泽叶生物科技有限公司,批号ATA34139、AB20190712)。

1.2建模及分组 随机选10只大鼠为正常组,不做任何处理。其余30只建立慢性心律失常大鼠模型,尾静脉输注氯化钡溶液,禁食12 h,按体质量于腹腔输注2%戊巴比妥钠(1 ml/400 g)实施麻醉,对大鼠呈俯卧位进行固定,四肢内侧皮下放针状的电极,与心电图机(DB-3型)进行连接,调零基线,记录Ⅱ导联的心电图,后通过无菌棉消毒大鼠尾部,取微量注射器将0.4%氯化钡溶液4 mg/kg于尾静脉处进行输注,待包膜出现鼓起,即为输注完成,心电图记录0.5 h,心电图呈现出慢性心律失常,预示着成功建模,而由于建模期间有3只发生死亡,最终有27只成功建模,并将其随机分为模型组、上调组及下调组,每组各9只。其中,正常组操作同上,模型组给予0.9%氯化钠溶液于尾部静脉输注,上调组给予10 μl miR-29过表达慢病毒悬液在尾部实施静脉注入,下调组给予10 μl miR-29沉默慢病毒悬液于尾部进行静脉注射。

1.3苏木素-伊红(HE)染色 完成实验后,抽取静脉血,行离心处理,分离清液,-20 ℃环境中储存,待检。对大鼠给予2%戊巴比妥钠麻醉后进行断颈处死,将其心肌组织取出,放入4%多聚甲醛溶液内进行固定,放-80 ℃冰箱内储存,备用。取部分心肌组织,制备常规石蜡切片,接着实施脱蜡、水化等操作后,选取苏木素进行染色,加盐酸乙醇实施分化直到返蓝,加乙醇伊红复染,接着脱水处理,封片固定,在光镜对病理组织进行观察。

1.4NT-proBNP水平测定 选取酶联免疫吸附试验(ELISA)对NT-proBNP水平进行测定,试剂盒由(山东一达生物科技有限公司)提供,按试剂盒说明书严格操作,将清液样本于室温内放30 s,预先备好标准清液与溶液,配洗板液300 μl,洗30 s酶标板,晾晒干,酶标孔中放检测缓冲液50 μl、标准液50 μl、清液样本及待测抗体,封板,震匀,37 ℃环境下经2 h培养,洗板,于孔中加100 μl 酶标记物,封板,震匀,放室温中40 min,洗板,加100 μl底物液,遮光下培养30 min,加终止液100 μl,摇匀,于450 nm波长处用酶标仪对吸光值予以测定。

1.5心功能指标及血流动力学指标测定 采用由青岛东方卫尔医疗科技有限公司提供的飞利浦彩超CV650医用多普勒超声诊断仪测定左室收缩末期内径(LVESD)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室射血分数(LVEF)水平变化。无创血流动力学检测仪测定收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、平均动脉压(MAP)、心率(HR)。

1.6miR-29表达检测 选取实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法对miR-29表达予以测定,转染心肌细胞成功后,通过Trizol法对细胞中总RNA进行提取,用mRNA逆转录试剂盒实施逆转录得到cDNA,提取细胞总RNA,选用Primer5.0软件对引物予以设计,反应条件为:95 ℃ 35 s、92 ℃ 10 s、65 ℃ 30 s,共有45个循环,2-△△Ct法算出相对表达量。重复实验3次,取其平均数值。内参为磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。

1.7Nrf2/HO-1通路蛋白相对表达量对比 采用Western印迹法对Nrf2/HO-1信号通路蛋白表达量进行检测,对所有培养细胞实施离心处理,提取蛋白后,用二喹啉甲酸(BCA)测定蛋白量,于10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺缓冲液中添加蛋白500 μl,通过转膜、取膜、固定及做电泳操作后,封闭1.5 h,按比例1∶1 000稀释Tris盐酸缓冲液吐温(TBST),Nrf2/HO-1、β-actin一抗,4 ℃下过一夜,洗膜3次,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶8 000),培养1 h,3次洗膜,行显色处理,记录蛋白相对表达量,内参为β-actin。

1.8统计学处理 采用SPSS19.0软件进行方差分析及独立样本t检验。

2 结 果

2.1各组心肌组织病理学观察 如图1所示,正常组心肌组织结构较为完整,未伴有水肿、充血等;模型组心肌组织排列无规则,且伴有较多的水肿、坏死、充血等表现,炎性细胞浸润较为显著;上调组心肌组织水肿、炎性浸润情况有所改善;下调组心肌组织发生充血、坏死、水肿等情况,炎性细胞严重浸润。

图1 各组心肌组织学病理(HE染色,×400)

2.2转染效率鉴定 如表1所示,与正常组对比,模型组、上调组及下调组miR-29表达量均显著升高(P<0.05);与模型组对比,上调组miR-29表达量显著升高,下调组miR-29表达量显著降低(P<0.05);与上调组对比,下调组miR-29表达量显著降低(P<0.05),说明miR-29转染成功。

2.3各组血流动力学指标比较 如表1所示,与正常组相比,模型组、上调组、下调组SBP、DBP、MAP水平显著下降(P<0.05);与模型组相比,上调组、下调组SBP、DBP、MAP水平显著上升(P<0.05);与上调组相比,下调组SBP、DBP、MAP水平显著升高(P<0.05)。

2.4各组心功能相关指标变化 如表1所示,与正常组相比,模型组、上调组、下调组LVESD、LVEDD水平显著升高,LVEF水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,上调组LVESD、LVEDD、LVEF水平显著升高,下调组LVESD、LVEDD水平显著降低,LVEF水平显著升高(P<0.05);与上调组相比,下调组LVESD、LVEDD水平显著降低,LVEF水平显著升高(P<0.05)。

表1 各组miR-29表达量、血流动力学指标及心功能相关指标比较

2.5各组NT-proBNP、HR水平对比 如表2所示,与正常组相比,模型组、上调组、下调组HR显著降低,NT-proBNP水平显著上升(P<0.05);与模型组相比,上调组NT-proBNP、HR水平显著升高,下调组HR显著升高,NT-proBNP水平显著降低(P<0.05);与上调组相比,下调组HR显著上升,NT-proBNP水平显著下降(P<0.05)。

2.6各组Nrf2/HO-1通路蛋白表达对比 如表2、图2所示 与正常组对比,模型组、上调组Nrf2、HO-1表达显著上升,下调组Nrf2表达显著下降,HO-1表达显著上升(P<0.05);与模型组对比,上调组HO-1、Nrf2表达显著升高,下调组Nrf2表达显著下降, HO-1表达显著上升(P<0.05);与上调组对比,下调组Nrf2、HO-1表达显著下降(P<0.05)。

表2 各组NT-proBNP、HR水平及Nrf2/HO-1通路蛋白表达

图2 Western印迹检测各组Nrf2/HO-1通路蛋白表达

3 讨 论

研究显示〔8〕,miR在转录水平上有抑制该靶基因mRNA的翻译或降解目标mRNA以对蛋白质表达调控起到了主要作用。miR是长约22 nt的非编码RNA,在血清、血浆中相对平稳,故miR在细胞增殖、分化、凋亡及机体代谢中有一定作用〔9〕。研究发现,miR在心脏疾病过程中具有调控作用,其上调或下调可导致离子通道亚单位的基因表达紊乱,导致离子机体生理功能失调、紊乱,引起心律失常的发生〔10〕。miR-29是mRNA的一种,由此可知miR为20～24个核苷酸构成的短链非编码RNA分子,在真核细胞中存在,可经与靶序列进行结合以反映其基因表达,为研究治疗提供了新靶点〔11,12〕。研究发现,miR-29在心肌梗死患者中表达异常升高,其外源性miR-29给药处理可引起大鼠缺血性心律失常的发生,因此心律失常疾病的发生和发展与miR-29的表达呈正相关〔13〕。本研究结果显示,下调miR-29表达可有效发挥抗心律失常作用,同时改善心肌组织血流动力学指标水平。

Nrf2为上游调控基因,在正常生理条件下,Nrf2存在于与阴性调节蛋白Kelch样ECH相关蛋白(Keap)1相关的细胞质中,该蛋白与Nrf2相互作用充当衔接蛋白,维持Nrf2低水平〔14〕。此外,Nrf2激活增强了先天免疫系统的活性进而发挥其保护效应。Keap1可通过氧化还原敏感的半胱氨酸残基的结合来检测氧化应激,并且从Keap1介导的抑制中释放Nrf2,增强细胞对氧化应激的拮抗能力〔15,16〕。HO-1是一种重要的抗氧化酶,是催化血红素分解代谢成亚铁、一氧化碳和胆绿素的转录因子,参与发挥血管的保护作用〔17〕。研究发现,HO-1表达上调,在动脉粥样硬化等心血管疾病中表现出防御保护作用〔18〕。研究发现,在氧化应激状态下可通过Nrf2通路诱导HO-1蛋白表达,起抗氧化作用〔19〕。本研究说明,心律失常可诱导氧化应激的发生,并激活Nrf2蛋白表达,进而诱导HO-1蛋白表达增强。本研究还提示,下调miR-29可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路的表达发挥其保护作用。