miR-361-3p通过靶向S100A6抑制甲状腺癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的机制

姜岩松 赵志国 张冰心 杨强 白吉明

(承德市中心医院 1检验科,河北 承德 067000;2输血科;3甲乳直肠外科)

甲状腺癌是临床上最常见的内分泌肿瘤。调查显示,甲状腺癌的发病率呈逐年上升趋势,这可能与诊断技术的不断发展有关〔1〕。大多数甲状腺癌患者经治疗后均可痊愈,死亡率很低,但是间变性甲状腺癌的死亡率高达90%〔2〕。间变性甲状腺癌十分罕见,约占甲状腺恶性肿瘤的2%。常见的甲状腺恶性肿瘤为甲状腺乳头状癌、滤泡状癌,分别占79%、13%〔3〕。非编码RNA是一种在基因合成过程中产生的长短不一的单链核酸片段,包括200 个核酸以上的长链非编码RNA、18～22个核酸的短链微小RNA和环状RNA等,其中微小(mi)RNA是最先发现肿瘤调控非编码RNA〔4,5〕。如今,miRNA通过调控靶基因的转录、翻译过程参与调控多种癌症的进展作用已得到普遍认可,但是仍有部分新发现的miRNA的功能仍有待进一步探究。 miR-361-3p是甲状腺癌中新发现的miRNA,其功能研究仍处于初步探索阶段。

S100A6是S100钙结合蛋白家族成员,位于人类染色体1q21,该染色体经常发生异常,可导致人类的多种疾病(先天性智力低下、畸形、心脏病等)〔6～8〕。已有研究证明,S100A6促进胃癌、肺癌、骨肉瘤和胰腺癌细胞的上皮-间充质转化、增殖和迁移侵袭〔9,10〕。本研究旨在探究 miR-361-3p通过靶向S100A6抑制在甲状腺癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1材料 组织样本来自承德市中心医院2018年7月至2021年2月接收的30例甲状腺癌切除术患者的癌组织及对应的癌旁组织。患者及家属均签署知情同意书。人甲状腺正常细胞Nthy-ori 3-1、甲状腺癌细胞TPC-1、SW579和CAL-62均购自美国菌种保藏中心;逆转录定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)试剂盒购自北京康为世纪;细胞计数试剂盒(CCK)8购自日本同仁;Transwell小室购自美国Corning;5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EDU)细胞增殖检测试剂盒购自上海碧云天。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自日本TaKaRa。

1.2细胞培养 Nthy-ori 3-1、TPC-1、SW579和CAL-62细胞均使用含15%胎牛血清的DMEM培养基,37 ℃、5%CO2的饱和湿度恒温细胞培养箱中常规培养。隔天更换1次培养液。

1.3分组与转染 将培养48 h的Nthy-ori 3-1、TPC-1、SW579和CAL-62细胞设为Nthy-ori 3-1、TPC-1、SW579和CAL-62组。取3倍量的脂质体将miR-con组、 miR-361-3p组、si-con组、si-S100A6组、 miR-361-3p+pcDNA组、 miR-361-3p+pcDNA-S100A6组转染至CAL-62细胞,转染10 h后更换新培养基继续培养48 h。RT-qPCR、Western印迹法检测转染效率。

1.4RT-qPCR实验 收集对数生长期细胞,Trizol液提取总RNA,并反转录为cRNA,-20 ℃保存,作为qPCR模板。按照qPCR试剂盒说明要求操作,检测其中 miR-361-3p、S100A6的表达。以U6、GAPDH为内参,2-ΔΔCt法计算结果。 miR-361-3p(5′-3′)正向引物ATAAAGRGCRGACAGTGCAGATAGTG,反向TCAAGTACCCACAGTGCGGT;S100A6(5′-3′)正向引物AAGCTGCAGGATGCTGAAAT,反向CCCTTGAGGGCTTCATTGTA。U6(5′-3′)正向引物GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT,反向CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT;GAPDH(5′-3′)正向引物CGACCACTTTGTCAAGCTCA,反向ACTGAGTGTGGCAGGGACTC。循环条件为95 ℃下初始变性10 min,然后在95 ℃变性15 s,60 ℃退火1 min,进行40次循环。

1.5Western印迹实验检测 无菌研磨组织样本,放射免疫沉淀(RIPA)裂解,提取总蛋白。对数生长期细胞用同样的方法裂解,提取总蛋白。二喹啉甲酸(BCA)试剂盒定量,沸水浴变性。行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),转膜仪湿转蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。转膜后,用2.0%脱脂奶粉的封闭液37 ℃处理2 h。滴加稀释的一抗溶液(兔抗S100A6多抗,1∶1 000)4 ℃冰箱孵育过夜。再滴加稀释的二抗溶液〔辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗,1∶500〕,37 ℃温箱孵育2 h。滴加电化学发光(ECL)液,显色,曝光。ImageJ分析条带的灰度值,用目的蛋白灰度与内参蛋白灰度的比值表示蛋白水平。

1.6CCK8实验 收集对数生长期miR-con组、 miR-361-3p组、si-con组、si-S100A6组、 miR-361-3p+pcDNA组、 miR-361-3p+pcDNA-S100A6组细胞,培养液调至0.5×105个/ml,取200 μl置于96孔板,分别培养12、24、48 h。取CCK8试剂盒中的CCK液20 μl,轻轻震荡混匀,避光孵育15 min。490 nm波长下检测细胞的吸光度(OD)值。

1.7EDU增殖检测实验 收集对数生长期细胞,接种在24孔板,按照BeyoClickTMEDU-488细胞增殖检测试剂盒要求操作,检测分析细胞的增殖情况。用EDU(300 μl)与细胞孵育3 h,洗涤。多聚甲醛固定30 min,0.5%Triton X-100渗透脱色10 min,最后用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色细胞核30 min。荧光显微镜观察EDU阳性染色细胞数量、细胞总数量,计算EDU阳性率。EDU阳性率(%)=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.8划痕实验 收集对数生长期细胞,接种至不含血清和双抗的DMEM培养基的24孔板(24孔板的背面每划5条平行直线)。常规培养细胞至融合度至80%左右,用200 μl的枪头垂直孔底,平行板背面的直线划线。冲洗脱落的细胞,五点法拍照。细胞培养24 h后,再次拍照。ImageJ软件分析划痕的愈合情况。划痕愈合率(%)=(0 h宽度-24 h宽度)/0 h宽度×100%。

1.9Transwell实验 收集对数生长期细胞,更换无血清的培养基饥饿培养12 h。取200 μl均匀铺在不含基质胶的小室(迁移能力)上室表面,取600 μl含血清的培养基至下室,常规细胞培养12 h。用于细胞的甲醛固定,结晶紫染色,显微镜下计数,结果取平均值。细胞侵袭力的检测将小室更换为含有基质胶的小室即可,其他操作同上。

1.10双荧光素酶报告基因检测实验 Targetscan在线预测软件(http://www.targetscan.org/)发现S100A6是 miR-361-3p的一个靶基因。依据预测到的结合位点化学合成S100A6野生片段(含S100A6结合位点)和S100A6突变片段(不含S100A6结合位点)的核酸序列,插入荧光载体,构建荧光素酶报告基因。将miR-con、 miR-361-3p、anti-miR-con、anti-miR-361-3p分别与荧光报告基因载体共转染CAL-62细胞。双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测、计算细胞的荧光活性。

1.11统计学处理 采用SPSS23.0软件进行t检验、方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1miR-361-3p 在甲状腺癌中的表达 与癌旁组织(0.95±0.06)相比,癌组织中 miR-361-3p表达(0.68±0.13)显著降低(t=14.968,P=0.000)。与Nthy-ori 3-1组(0.93±0.07)相比,TPC-1、SW579和CAL-62组 miR-361-3p表达(0.50±0.10、0.52±0.06、0.45±0.05)均显著降低(均P<0.05)。CAL-62组细胞 miR-361-3p的降低幅度最大,对 miR-361-3p的敏感性最高,故选用CAL-62细胞用于后续研究。

2.2过表达 miR-361-3p调控CAL-62增殖、凋亡 与miR-con组相比, miR-361-3p组细胞 miR-361-3p表达显著升高,24、48、72 h细胞活性均显著降低,EDU阳性率显著降低(P<0.05)。见图1、表1。

图1 两组甲状腺癌细胞CAL-62增殖(EDU法,×100)

2.3过表达 miR-361-3p调控CAL-62迁移侵袭 与miR-con组相比, miR-361-3p组细胞划痕愈合率显著升高,迁移细胞数和侵袭细胞数均显著降低(P<0.05)。见表1、图2。

表1 过表达 miR-361-3p抑制CAL-62增殖、凋亡、迁移和侵袭

图2 过表达 miR-361-3p的CAL-62细胞迁移、侵袭

2.4miR-361-3p靶向S100A6 targetscan在线预网站(http://www.targetscan.org/)预测到S100A6与 miR-361-3p之间存在连续的互补结合位点,见图3。miR-con组相比, miR-361-3p组WT-S100A6细胞荧光活性显著降低,MUT-S100A6细胞荧光活性变化不显著,S100A6蛋白表达显著降低(P<0.05);与anti-miR-con组相比,anti-miR-361-3p组WT-S100A6、MUT-S100A6细胞的荧光活性变化均不显著,S100A6蛋白表达显著升高(P<0.05),见图4、表2。

图3 S100A6与miR-361-3p存在连续互补的结合位点

2.5敲减S100A6 调控CAL-62增殖、迁移侵袭和凋亡 与si-con组相比,si-S100A6组细胞S100A6蛋白表达、24、48、72 h细胞活性、EDU阳性率、细胞迁移、侵袭数量均显著降低,划痕愈合率显著升高(P<0.05)。见图4、表3。

1～10:miR-con组、miR-361-3p组、anti-miR-con组、anti-miR-361-3p组、癌旁组织、癌组织、si-con组、si-100A6组、miR-361-3p+pcDNA组、miR-361-3p+pcDNA-S100A6组图4 各组S100A6蛋白表达

2.6过表达S100A6和 miR-361-3p影响甲状腺癌细胞CAL-62增殖、迁移、侵袭 与 miR-361-3p+pcDNA组相比, miR-361-3p+pcDNA-S100A6组细胞S100A6蛋白表达显著升高,24、48、72 h细胞活性、EDU阳性率、细胞迁移、侵袭数量显著升高,划痕愈合率显著降低(P<0.05),见图4、表4。

表2 双荧光素酶报告实验

表3 敲减S100A6 抑制甲状腺癌细胞CAL-62增殖、迁移和侵袭

2.7miR-361-3pt S100A6 mRNA相关性 与癌旁组织(1.05±0.12、0.36±0.07)相比,癌组织中S100A6 mRNA和蛋白表达(4.45±0.35、0.76±0.13)均显著升高(t=72.937、21.503;均P<0.05)。癌组织中 miR-361-3p相对表达与S100A6相对表达呈显著负相关(P<0.05)。见图4、图5。

表4 过表达 miR-361-3p和S100A6 调控CAL-62增殖、迁移侵袭和凋亡

图5 miR-361-3p和S100A6 mRNA相关性

3 讨 论

miR-361被证明在乳腺癌、肺癌、胃癌等实体肿瘤中的表达受到抑制〔11〕。Xia等〔12〕研究报道,miR-361-3p作为Hsa_circ_0011385的靶向因子参与甲状腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、细胞周期阻滞和凋亡过程,揭示Hsa_Circ0011385通过靶向miR-361-3p促进甲状腺癌细胞增殖、侵袭、迁移,抑制甲状腺癌细胞周期阻滞和凋亡,提示Hsa_Circ0011385/miR-361-3p通路可能是甲状腺癌的一个有希望的治疗靶点。Li等〔13〕报道,miR-361-5p过度表达可在体外显著抑制甲状腺癌细胞增殖、迁移、侵袭,在体内抑制肿瘤的生长。本研究发现,miR-361-3p在甲状腺癌组织和癌细胞中的表达水平均发生明显下调。过表达miR-361-3p明显的抑制了癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力,增强了癌细胞的凋亡能力,说明miR-361-3p在甲状腺癌的治疗中具有成为潜在治疗靶点的价值。miR-361-3p具有靶向负调控S100A6的功能,推测这可能与miR-361-3p在甲状腺癌中调控甲状腺癌细胞表型变化的潜在机制有关。

有研究〔14〕表明,S100A6在甲状腺乳头状癌中的表达显著升高,肿瘤的免疫组化分析显示,乳头状甲状腺癌患者的胞质染色明显强于滤泡性甲状腺癌,且染色的细胞核比例更大,说明S100A6在甲状腺癌中具有促进作用,并可能有助于区分滤泡性甲状腺癌和乳头状甲状腺癌〔14〕。Nipp等〔15〕研究发现,S100-A10、S100-A10在转移性甲状腺癌中的表达明显升高,并与淋巴转移的程度高度相关,此外,其还与转化生长因子(TGF)-β依赖性上皮间质化途径密切相关,提示S100-A10、S100-A10可能在转移性甲状腺癌的诊断中具有生物价值。Li等〔16〕研究发现,S100A2/4/6/10/14/16在胰腺导管腺癌(PDAC)组织中的表达水平显著高于正常胰腺组织,而S100A2/4/6/10/14/16在PDAC中的启动子甲基化水平低于正常组织,它们的表达与PDAC患者的生存率呈负相关,表明S100A2/4/6/10/14/16可作为PDAC患者预后的生物标志物。由此可见,S100A6在内分泌肿瘤中发挥致癌功能,但是其发挥作用的机制仍有待继续研究。本研究发现,敲减S100A6明显抑制了甲状腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭,促进凋亡,说明S100A6的抑制具有抗甲状腺癌作用,再次证实了前S100A6在甲状腺癌中的致癌功能。此外,过表达S100A6后还能够部分逆转过表达 miR-361-3p对甲状腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭抑制和凋亡促进作用。

综上, miR-361-3p在甲状腺癌组织、癌细胞中表达降低,具有抑制癌细胞增殖、迁移侵袭,促进凋亡的作用,其机制与靶向抑制S100A6表达相关。