基于巨噬细胞自噬探讨畅脉乐胶囊对动脉粥样硬化大鼠斑块稳定性及凝血功能影响的机制

黄松雄 张玉琴 刘巧婷 李志 吴帮发 何洪金

(福建中医药大学附属第二人民医院,福建 福州 350003)

心脑血管疾病是全球第一大致死病因,已成为人类社会和国家的重要经济负担,而动脉粥样硬化是引发这些心脑血管疾病的病理基础,因此如何有效防治该病的发生、发展一直是临床工作的重点之一〔1,2〕。动脉粥样硬化的致病原因主要为脂代谢异常、大量的吸烟及饮酒、遗传因素等,其标志性病变是斑块的形成,研究表明,动脉粥样硬化斑块的稳定与否是导致心脑血管发病及死亡的关键原因,因此深入探讨动脉粥样硬化斑块稳定性的机制有望成为心脑血管疾病防治的新方向〔3,4〕。近年来研究发现,慢性炎症反应是不稳定动脉粥样硬化斑块形成的关键,而巨噬细胞作为机体重要的炎症细胞在其中发挥了不可或缺的作用,其可通过吞噬脂滴形成泡沫细胞并在斑块内堆积,从而释放细胞因子诱发炎症反应,进而促进斑块的形成并增加斑块的不稳定性,故如何降低巨噬细胞聚集已经成为目前医学领域关注的焦点之一〔5〕。而早有研究证实,巨噬细胞自噬具有抗动脉粥样硬化作用,促进巨噬细胞自噬可以促进斑块稳定,减缓斑块进展,因此探寻一种有效的手段促进巨噬细胞自噬就显得尤为重要〔6〕。动脉粥样硬化患者由于斑块的形成及增多,会导致动脉血流动力学特性改变,从而造成机体凝血功能异常,进而影响机体纤溶功能及抗凝功能,加速血栓的形成,最终导致恶性循环的形成,因此了解患者凝血功能情况有利于临床的诊断及治疗〔7〕。目前,临床上治疗动脉粥样硬化多采用他汀类调脂药物等西医治疗,但其具有一定副作用,并且停药后很容易反弹,中医药治疗本病具有多靶点、多渠道、几乎无副作用的优点,且临床疗效已经得到证实,故日益受到研究者重视〔8〕。畅脉乐胶囊是在中医传统理论指导下,结合现代药理研究成果,由多种中药研制而成,其中包括葛根、郁金、黄芪、丹参等药材,在填精养血、破血逐瘀、散瘀止痛、抗动脉粥样硬化等方面具有显著疗效〔9〕。因此,本文就基于巨噬细胞自噬探讨畅脉乐胶囊对动脉粥样硬化大鼠斑块稳定性及凝血功能影响的机制,以期为畅脉乐胶囊的疗效提供客观量化的标准,为临床提供更多、更可靠的诊疗依据。

1 材料与方法

1.1动物材料 选取广州弗尔博生物科技有限公司提供的50只SPF级SD雄性大鼠〔合格证书为:SCXK(粤)2020-0009〕,体质量200～250 g,大鼠单笼喂养,室温生长,模仿12 h昼夜交替,在常温下进行适应性喂养7 w,按照《实验动物管理条例》规定进行实验。

1.2实验材料 畅脉乐胶囊(医院自制,规格:0.35 g);维生素D3(货号:YT63592,北京伊塔有限公司);苏木素染液(货号:H9627,美国Sigma公司);伊红染液(货号:AG1100～100 ml,上海吉至有限公司);光学显微镜(型号:CX-60,日本OLYMPUS公司);凝血检测仪(货号:STA-R Evolution,北京思塔高有限责任公司);4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液(货号:FT21949yy,上海梵态有限公司);透射电子显微镜(型号:LVEM5,深圳赛普思有限公司);改良油红O染色液(货号:SY2474,北京伊塔有限公司);细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)抗体(货号:ATA28655,武汉益普有限公司);自噬相关蛋白螯合体(SQSTM)1抗体(货号:PL0402596,深圳豪地华拓有限公司);微管相关蛋白1A/1B-轻链(LC)3抗体(货号:bs-8878R,上海科敏生物科技有限公司);荧光显微镜(型号:Primo Star iLED,上海卡尔蔡司有限公司)。

1.3建模 随机选取40只大鼠,禁食12 h后,给大鼠灌胃30万IU/kg维生素D3、25 mg/kg尼古丁,10 h后再次给大鼠灌胃25 mg/kg尼古丁,同时每天按30 g/kg给大鼠喂养高脂饲料,喂养8 w后,随机选择5只大鼠并处死。取颈动脉作病理切片,动脉内有陈旧斑块、斑块内脂质崩解、弹性纤维断裂、纤维帽内钙盐沉积,则视为建模成功。

1.4分组与给药 随机选取建模成功大鼠30只,将其随机分为模型(MO)组,低剂量畅脉乐胶囊(LC)组,高剂量畅脉乐胶囊(HC)组,每组10只,未建模10只健康大鼠作为正常(CO)组,LC组灌胃5 mg/kg的畅脉乐胶囊,HC组灌胃15 mg/kg的畅脉乐胶囊,两组均每天一次,治疗28 d,CO组、MO组同期给予灌胃同体积生理盐水。

1.5标本采集 实验完成后,通过腹腔注射3%戊巴比妥将大鼠麻醉处死,并从主动脉采血,然后取主动脉组织,主动脉血在4 ℃、2 000 r/min条件下离心10 min,取上清液于无菌离心管中,在冰箱中密封保存,取部分血管组织剪碎置于离心管中以提取巨噬细胞,首先加入4型胶原酶使其终浓度为1 mg/ml,在37 ℃下,300 r/min的摇床上摇晃1 h后过滤离心,弃掉上清液,重悬后再次离心,弃掉上清液,重悬后在4 ℃下沉淀离心3次,取3次上清液,3次上清液混合后,4 ℃下离心5 min,弃掉上清液,再次重悬后将其小心铺到25%～50%的细胞分离液(percoll)上方,每部分体积为4 ml,然后在室温,2 000 r/min,降速调为1的条件下进行梯度离心20 min,离心后在25%与50%界限处的为巨噬细胞;剩余主动脉用4%的多聚甲醛溶液固定96 h后,用生理盐水漂洗干净,放入冰箱中密封保存。

1.6大鼠病理组织苏木素-伊红(HE)染色 取各组主动脉组织,进行多聚甲醛及梯度沉糖脱水、石蜡包埋、切片、烤片、二甲苯及梯度乙醇脱蜡、复水后,进行HE染色,染色完成后除去多余染液,进行脱水、二甲苯透明和中性树胶封片处理,在光学显微镜下随机选取3个视野进行组织病理学观察。

1.7大鼠凝血功能检测 取各组大鼠500 μl血清,用凝血检测仪对凝血酶原时间(PT)、国际标准比率(INR)、血浆纤维蛋白原(FIB)含量进行检测并记录。

1.8油红O染色法检测巨噬细胞泡沫化情况 取各组大鼠巨噬细胞,4%多聚甲醛固定10 min 后,加入蒸馏水稍微冲洗,加入60%异丙醇浸泡30 s,加入改性油红O染色溶液,密封15 min,加入60%异丙醇稍微清洗,去除染料溶液,将蒸馏水稍微清洗,苏木素染色溶液保持2 min,加入磷酸盐缓冲液(PBS)促进蓝色,蒸馏水稍微清洗,甘油明胶密封,显微镜下观察巨噬细胞泡沫,脂滴染红,细胞核染蓝。

1.9电镜观察巨噬细胞中脂滴及自噬体形成 取各组大鼠巨噬细胞,采用透射电子显微镜观察其脂滴及自噬体的形成,实验步骤需严格按照仪器说明书进行。

1.10免疫荧光法检测巨噬细胞中EMMPRIN、SQSTM1、LC3的蛋白表达 取各组巨噬细胞,常规培养至细胞密度达80%～90%,将细胞消化接爬片,待细胞完全贴壁,吸除培养基,加入4%多聚甲醛进行细胞固定,室温固定20 min,PBS洗涤3次,加入0.5% Triton X-100,室温通透20 min,PBS洗涤3次,5%BSA封闭2 h,吸去封闭液,滴加稀释的EMMPRIN、SQSTM1、LC3一抗(1∶200),4 ℃湿盒内孵育过夜,PBS洗涤3次,滴加荧光素标记的二抗(1∶200),37 ℃室温避光孵育1 h,PBS洗涤3次,滴加DAPI复染细胞核,避光孵育5 min,PBS轻洗细胞3次,用吸水纸吸干爬片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片,在荧光显微镜下观察并采集图像。

1.11统计学分析 采用GraphPad Prism8.0进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组HE染色结果 CO组主动脉组织结构正常完整且排列整齐,内、中、外膜层清晰可见,分界清楚,可见数层弹力膜,未见泡沫细胞,且无明显斑块形成;MO组主动脉结构紊乱,内膜明显增厚,可见脂质斑块弥漫及大量泡沫细胞和炎性细胞浸润,并可见典型的不稳定斑块;与MO组比较,LC、HC组病理结构明显改善,主动脉可见典型的稳定斑块及较少的泡沫细胞,炎性细胞明显减少,见图1。与MO组比较,LC、HC组内膜与中膜面积比显著降低,斑块稳定性显著升高(P<0.05);HC组上标指标显著优于LC组(P<0.05)。见表1。

图1 各组肺组织(HE染色,×200)

2.2各组凝血功能结果 与CO组比较,MO组血清中PT、INR显著降低(P<0.05),FIB显著升高(P<0.05);与MO组比较LC、HC组血清中PT、INR显著升高,FIB明显降低(P<0.05),且HC组比LC组变化显著(P<0.05),见表1。

表1 各组内膜与中膜面积比、斑块稳定性凝血功能指标比较

2.3各组巨噬细胞中EMMPRIN、SQSTM1、LC3蛋白表达结果 与CO组比较,MO组巨噬细胞中EMMPRIN、SQSTM1蛋白表达显著升高(P<0.05),LC3显著降低(P<0.05);与MO组比较,LC组、HC组巨噬细胞中EMMPRIN、SQSTM1蛋白表达显著降低(P<0.05),LC3显著升高(P<0.05),且HC组比LC组变化显著(P<0.05),见表2、图2。

表2 各组巨噬细胞中EMMPRIN、SQSTM1、LC3蛋白表达

图2 各组巨噬细胞中EMMPRIN、SQSTM1、LC3蛋白表达(免疫荧光染色,×400)

2.4各组巨噬细胞油红O染色 CO组巨噬细胞染色较淡,未见巨噬细胞泡沫化及明显脂滴颗粒,MO组巨噬细胞被染成红色的区域数量明显增加,可见巨噬细胞出现泡沫化,与MO组比较,LC组、HC组脂滴数量明显减少,巨噬细胞泡沫化程度明显减轻,见图3。

图3 各组巨噬细胞(油红O染色,×200)

2.5各组巨噬细胞电镜结果 与CO组相比,MO组脂滴数量明显增多,自噬体数量明显减少,与MO组相比,LC组、HC组脂滴数量明显减少,自噬体数量明显增多,且HC组比LC组变化明显,见图4。

图4 电镜观察各组巨噬细胞(×800)

3 讨 论

本研究发现,畅脉乐胶囊对动脉粥样硬化大鼠具有显著疗效,可显著改善大鼠主动脉组织病理形态,降低内膜与中膜面积比并提高斑块稳定性,且高剂量效果更显著。近年来研究发现,动脉粥样硬化引起的血管狭窄并不是急性心脑血管事件发生的主要因素,其斑块发生破裂、脱落,使斑块从“稳定斑块”向“不稳定斑块”转变,从而引起的出血或形成血栓堵塞血管才是导致急性心脑血管疾病发生的关键因素,因此,如何提高斑块稳定性一直是临床关注的焦点之一〔10〕。中医认为,气为血之帅,气行则血行,气虚则无力鼓动血行而瘀滞,或气虚血亏,脉道艰涩使血行不畅而致血瘀,故动脉粥样硬化早期多气血虚而脉络瘀滞不通为病,主要以补虚与祛邪相结,采用扶正祛邪为主,活血祛痰解毒之法,或健脾补肾之法为辅的方法则来治疗该病〔11〕。而畅脉乐胶囊是一种标本兼顾、攻补兼施的院内中药复合制剂,方中水蛭活血化瘀,丹参活血凉血,此二药共助血脉通利以治其瘀阻不通,而郁金行气解郁,何首乌补肾活血,黄芪益气健脾,葛根舒筋通络,这四药兼具行气祛瘀,不伤而全攻补,共奏益气活血,去瘀新功效,且临床研究表明,其具有降血脂,抗动脉粥样硬化的显著疗效〔12〕。对于动脉粥样硬化大鼠,畅脉乐胶囊主要是通过标本同治、攻补兼施、益气活血化瘀,来改善血管通透性、改善机体微循环、减少血栓的形成,从而加速血液运行,增加血流供应,进而促进血管内皮细胞修复和新生、抑制血管壁的微血管新生、抑制血管平滑肌细胞增殖等,最终达到增加斑块稳定性,延缓动脉粥样硬化病变发展的目的。谢胜伟等〔13〕研究表明,对于颈动脉粥样硬化大鼠,畅脉乐胶囊具有显著疗效,可显著降低三酰甘油、总胆固醇及低密度脂蛋白水平,并通过抑制Wnt信号通路来减轻颈动脉粥样硬化程度,这与本文结果类似。

本文说明,畅脉乐胶囊可有效改善大鼠凝血功能。动脉粥样硬化最常见的临床症状之一就是凝血功能的改变,研究表明,凝血因素直接参与动脉血栓的形成过程,因此对其进行检测可有效反映该病的临床治疗效果〔14〕。PT、INR、FIB是反映凝血功能的重要指标,因此检测其水平的变化,可有效反映凝血功能障碍情况〔15〕。而对于动脉粥样硬化大鼠畅脉乐胶囊主要是通过降低胆固醇及低密度脂蛋白等、抑制脂质过氧化及自由基反应,来干扰外源性凝血系统的活性,抑制类肝素物质分泌,从而降低血小板的黏附率、延长凝血时间,抑制凝血酶原向凝血酶转化及纤维蛋白原向纤维蛋白转变等,进而到达有效改善大鼠凝血功能的目的,最终减缓动脉粥样斑块形成。许磊等〔16〕研究发现,给予脑梗死恢复期合并颈动脉粥样硬化患者豁痰宣痹通脉方,可显著改善PT、FIB等凝血功能指标,缩小斑块面积,稳定斑块,这与本文结果类似。

本研究说明,畅脉乐胶囊可促进巨噬细胞自噬来提高动脉粥样硬化斑块稳定性。在动脉粥样硬化发生的初始阶段,动脉血管内皮受损,低密度脂蛋白进入血管内并沉积氧化,血管内膜中巨噬细胞摄取大量氧化型低密度脂蛋白后变成泡沫细胞,从而触发血管炎症反应,进而使斑块内炎症反应增加、出现坏死核心空洞等,斑块破裂的可能性明显增大,粥样斑块产生不稳定性,最终受损破裂,形成血栓,诱发心脑血管疾病的发生,因此减少斑块内巨噬细胞堆积、抑制其释放炎症及细胞因子的能力可望成为治疗的有效靶点〔17〕。研究表明,巨噬细胞自噬的激活在早期动脉粥样硬化病变中起着抗动脉粥样硬化的保护作用,但随着病变进展,晚期斑块巨噬细胞自噬活性逐渐降低,对脂质的清除作用减弱,其抗动脉粥样硬化作用逐渐降低,最终成为导致斑块进展和斑块不稳定的重要因素,故促进巨噬细胞自噬对斑块稳定性至关重要〔18〕。而EMMPRIN是动脉粥样硬化斑块稳定性相关蛋白,SQSTM1、LC3是目前在动脉粥样硬化领域研究较多的自噬调节蛋白,其水平的变化可有效反映动脉粥样硬化斑块稳定性及巨噬细胞自噬情况〔19〕。而对于动脉粥样硬化大鼠,畅脉乐胶囊可能是通过抑制炎性反应及氧化应激反应等,来调节巨噬细胞自噬相关蛋白的表达,促进巨噬细胞自噬,从而抑制巨噬细胞吞噬氧化型低密度脂蛋白,降低其泡沫化程度,进而促进泡沫细胞中脂质的分解排出,有效清除胆固醇,减少基质金属蛋白酶表达、抑制EMMPRIN的蛋白表达,最终稳定易损斑块,抑制斑块内出血、溃疡及斑块脱落,达到改善疾病症状的目的。刘琴〔20〕研究发现,小檗碱可显著改善动脉粥样硬化小鼠斑块脆弱性,降低斑块沉积,其机制可能与促进巨噬细胞自噬进而抑制炎性反应有关,这与本文结果类似。

综上所述,畅脉乐胶囊可显著改善动脉粥样硬化大鼠斑块稳定性及凝血功能,其作用机制可能与促进巨噬细胞自噬有关。