下调miR-146a对肺部细菌感染大鼠干预及作用机制

向仕菊 潘渝 陈金 王霞

(贵州省人民医院重症监护科,贵州 贵阳 550002)

肺部细菌感染在治疗后还会存在较为严重的气道黏膜损伤、气道反应性升高,其临床表现常见于咳嗽症状迁延不愈等,最终会转变为慢性持续性感染疾病〔1,2〕。miRNAs是当下感染疾病领域的研究中的热点,研究显示,miR-146a在人体肺泡上皮细胞中会发挥重要调控作用,其常参与各种肺部疾病的发生发展〔3,4〕。本研究探究下调miR-146a对肺部细菌感染大鼠的干预效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1研究动物 选取4～6周龄SPF健康雌性大鼠40只,平均体质量(114.83±10.60)g,由广西医科大学实验动物中心提供,动物许可证号:SCXK(桂)2021-0002。将大鼠置于专门实验饲养室中,保证室内光线充足,温度(23.07±2.13)℃,通风良好,昼夜节律为12 h,环境湿度保持在50%～60%,定期消毒、清扫鼠笼,及时更换垫料,保持1 w适应性饲养时间。主要试剂:流感嗜血杆菌1709菌株由解放军第960医院呼吸科临床分离,经VITEK系统鉴定;Ham F-12K培养基由美国Sigma Aldrich公司提供,胎牛血清(FBS)购自美国HyClone公司、苏木素-伊红(HE)染色试剂盒、聚合酶链反应(PCR)试剂盒均购自日本TaKaRa公司;miR-146a引物由上海源叶生物科技有限公司合成;全自动酶免分析仪购自美国Bio-Rad公司;酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自福州迈新公司。

1.2分组及模型构建 将40只大鼠依照随机分为假手术组、模型组、空白组、miR-146a转染组,每组各10只,将假手术组、模型组及miR-146a转染组大鼠以45 ml/kg 3%戊巴比妥腹腔麻醉,成功后取大鼠仰卧位固定于固定板中,用专用电动剃毛器将胸部、颈部脱毛。消毒后适度拉伸大鼠颈部,暴露大鼠喉头,在大鼠颈部正中切2～3 cm切口,分离大鼠前肌,暴露其气管并进行固定,于环甲软骨处剪V形切口,置入硅胶管,向大鼠气管右侧缓慢、倾斜注入流感嗜血杆菌琼脂小珠100 μl,完成后将大鼠直立10～20 s,使菌液最大可能分布于大鼠肺部。上述大鼠成功建模的只数分别为10、8、9只。miR-146a转染组:通过敲低miR-146a实现miR-146a下调,100 nmol/L转染miRNA抑制剂转染miR-146a,分为miR-146a转染组,模型组、假手术组、空白组使用100 nmol/L转染miRNA抑制剂转染无意义序列。

1.3样本采集 24 h后,将大鼠禁食禁水12 h,使用1%戊巴比妥钠溶液依照40 mg/kg的比例注射进大鼠腹腔,使其麻醉,静待,成功后,取其主动脉血5 ml,然后于3 000 r/min条件下,离心15 min,分离血清后分装于-70 ℃冰箱保存。处死大鼠,取出其肺组织,使用生理盐水进行冲洗,最后将其固定在比例为4%的多聚甲醛溶液中。

1.4病理组织学观察 将肺组织固定后进行常规脱水、包埋、切片、HE染色,观察其病理形态变化,光镜下肺部感染情况。

1.5miR-146a相对表达 实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测肺组织中miR-146a表达水平,采用Trizol法提取样本RNA,使用TaKaRa逆转录试剂盒行逆转录处理后获得总cDNA,采用Primer5.0软件设计引物序列,启动PCR仪,反应体系:0.4 μl上下游引物、1 μl cDNA模板、10 μl SYB Green,加蒸馏水至20 μl。反应条件:95 ℃预变性1 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 31 s,共进行40个循环,采用2-△△Ct方法计算出miR-146a相对表达。miR-146a上游引物:5'-CGTAGCATCCTTAGAACTCAGC-3′,下游5′-CCGCTCGAGGAA-CTATTGTTGAACGGCACT-3′。内参上游:5′-CATTGCC-GACAGGATGCA-3′,下游5′-GCCGATCCACACGGAGTACT-3′。

1.6白细胞介素(IL)-4、IL-1β、干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α、转化生长因子(TGF)-β、糖链抗原(KL)-6、水性表面活性蛋白(SP)-D水平 采用ELISA检测。提前稀释好将提前稀释好100 μl标本,将其置入微孔板标准孔,样品孔只加样品稀释液,混合均匀,在37 ℃下处理90 min,甩去孔内液体,吸干水分;将准备好的抗体加入样品孔、标准孔中0.1 ml,在37 ℃下处理60 min,甩去孔内液体,每孔中加满0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS),浸泡2 min后甩干孔内液体;每孔加入90 μl TMS,置于避光处20 min;每孔中加入90 μl TMS终止液。于波长450 mm处分析IL-4、IL-1β、IFN-γ、TNF-α、TGF-β、KL-6、SP-D水平。

1.7血气分析 构建模型24 h后,取腹主动脉血行血气分析送检做血气分析。

1.8统计学处理 采用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组病理组织 空白组肺泡形态均匀、结构完整,且上皮细胞形态正常,肺泡腔内未发现渗出的纤维蛋白,肺间质未发现炎性细胞、水肿及红细胞浸润;假手术组与空白组差异性并不明显,肺泡间隔正常,肺泡腔及肺泡结构较为完整,无明显肺组织损伤状况,但由于受实验操作的影响,假手术组肺部结构及形态稍有改变。模型组肺泡间隔出现明显增宽,微血管有充血、扩张现象,肺间质周围有明显炎性细胞浸润,且肺组织损伤较为严重。miR-146a转染组肺泡结构虽然不完整,但较模型组状况要好,肺组织损伤也较轻,肺泡及其周围炎性细胞逐渐减少,且肺泡间隔变窄,肺部结构趋于恢复正常。见图1。

图1 各组肺泡病理(HE染色,×200)

2.2各组miR-146a相对表达比较 miR-146a转染组miR-146a相对表达明显低于模型组、空白组,明显高于假手术组(P<0.05);模型组、空白组miR-146a相对表达明显高于假手术组(P<0.05);模型组、空白组miR-146a相对表达比较无显著差异(P>0.05)。见表1。

2.3各组炎症因子水平比较 miR-146a转染组IL-4、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平明显低于模型组,明显高于空白组、假手术组(P<0.05);空白组以上指标明显低于模型组(P<0.05),与假手术组无显著差异(P>0.05);模型组以上指标明显高于假手术组(P<0.05)。见表1。

表1 各组miR-146a表达、炎症因子水平比较

2.4各组血气指标比较 miR-146a转染组动脉血氧分压(PaO2)、PaO2/吸入气氧浓度(FiO2)明显低于假手术组、空白组,明显高于模型组(P<0.05);空白组以上指标明显高于模型组(P<0.05),与假手术组无显著差异(P>0.05);模型组以上指标明显低于假手术组(P<0.05)。见表2。

2.5各组肺泡灌洗液TGF-β、KL-6、SP-D水平比较 miR-146a转染组TGF-β、KL-6、SP-D水平明显低于模型组,明显高于空白组、假手术组(P<0.05);空白组以上指标明显低于模型组,与假手术组无显著差异(P>0.05);模型组以上指标明显高于假手术组(P<0.05)。见表2。

表2 各组PaO2、PaO2/FiO2、TGF-β、KL-6、SP-D水平比较

3 讨 论

肺部细菌感染在重症患者群体中较为多发,是造成重症死亡的关键〔5,6〕,主要是由于机体遭受常见致病菌的入侵而引发的肺部疾病〔7,8〕。当肺部感染后,肺泡中毛细血管上皮细胞会被破坏,进而引发肺部炎症及气体交换功能障碍。临床治疗肺部感染的常规手段之一是抗菌治疗,抑制相关病原菌感染,降低病原菌引发的肺损伤,但由于抗菌药物使用过于广泛,加上部分侵入性诊断、治疗手段的实施,令诸多病原菌的耐药性不断升高。

miR-146a作为内源性非编码RNA分子的一种,具有高度保守性,其属于miRNA与相关蛋白分子结合形成的复合物之一〔9,10〕。研究显示,沉默后miR-146a会抑制炎症相关基因表达,促进靶基因降解,同时miR-146a也会参与机体固有免疫反,在调控感染性疾病中起至关重要作用〔11,12〕。本研究结果提示,下调miR-146a会降低肺部细菌大鼠炎症水平,发挥抗炎作用,同时可以调节肺部感染大鼠血气水平,促进气体交换功能的改善。TGF-β是纤维细胞、肺泡巨噬细胞、气管平滑肌、内皮细胞等多种肺泡相关细胞的表达生长因子,其有引发气道组织肥厚、诱导血管内皮细胞生长因子产生与释放〔13,14〕。KL-6、SP-D属于肺泡表面的常见活性蛋白,其会发挥促进组织细胞修复及抑制病菌生长的作用〔15～17〕。既往研究发现,TGF-β、KL-6、SP-D在肺部细菌感染中会呈显著升高状态,且多项显示证实,它们会参与多种炎症介质的释放〔18～20〕。推测下调miR-146a会抑制肺部细菌感染的病理活动过程。当肺部受致病菌感染后,大量炎症因子相关基因的转录被启动,而miR-146a的靶基因是相关炎症因子通路中的重要接头蛋白编码基因,miR-146a下调后会抑制炎症因子及促炎因子释放,有助于改善肺组织感染状况,减轻肺损伤,有利于平滑肌重塑及呼吸功能的改善。虽然本文初步证实了,下调miR-146a可能是靶向调控治疗肺部细菌大鼠有效方案,但后续研究还需进一步理清该作用机制中路径。