基于TLR4炎症信号通路探讨针灸对颈性眩晕大鼠中缝背核神经元细胞活性及血管活性物质的影响

柳庆明 田利军 唐乐 巩凤梅

(济南市人民医院针灸推拿科,山东 济南 271100)

颈性眩晕是颈椎病临床常见分型之一,通常是由于颈椎骨骼、肌肉或软组织的异常导致,主要以眩晕等交感神经症状为主,故又称椎动脉型颈椎病〔1〕。颈椎病通常具有病程长、易复发的特点,而颈性眩晕严重时还会出现昏倒的情况,这不仅给患者带来了痛苦,还严重影响日常生活及工作〔2〕。目前,关于颈性眩晕的发病机制尚无明确定论,但有研究表明,炎症反应、颈交感神经刺激及体液因子紊乱与该病的发病密切相关,其都可造成椎基底动脉供血不足,从而诱发眩晕〔3〕。Toll 样受体(TLR)4炎症信号通路在炎症反应中发挥着重要作用,其可通过识别不同的病原体,来调控炎症因子、趋化因子、细胞因子等炎症介质,从而增强炎症反应〔4〕。中缝背核神经元是机体内稳态信息的传递重要途径,其与自身稳态的调节、感觉和运动控制、学习和认知等方面具有密切联系,且其支配区较大,与包括颈交感神经在内的各脑区有着复杂的神经纤维关系〔5〕。有研究表明,血管活性物质是引起眩晕的一种关键体液因子,其收缩、舒张血管物质之间的失衡可能是导致眩晕的关键因素〔6〕。目前临床上治疗颈性眩晕的手段纷繁复杂,但针灸治疗一直更受患者青睐,因其在缓解颈肩部疼痛、改善头晕症状方面具有确切疗效,且还具有操作简单易行、安全、无副作用及实用性强等优势〔7〕。但其对该病的具体作用机制研究相对较少,本文基于TLR4炎症信号通路探讨针灸对颈性眩晕大鼠中缝背核神经元细胞活性及血管活性物质的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物、仪器与试剂 北京化学试剂公司提供的60只SPF级SD大鼠〔合格证书为:SCXK(京)2019-0062〕,体质量215～295 g,饲养条件:23～26 ℃,相对湿度45%～69%,噪音<85 dB,无菌自由进食,进水2 w,按照《实验动物管理条例》规定进行实验。一次性使用无菌针灸针(HT0067,河南泽垣医疗器械销售有限公司);盐酸氟桂利嗪(西比灵,H10930003,西安杨森制药有限公司);平衡木(北京安默赛斯生物科技有限公司);高速冷冻离心机(M1324R,深圳市瑞沃德生命科技有限公司);TUNEL试剂盒(E-EL-0003,武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司);DAPI染色液(TDCF5001,武汉天德生物科技有限公司);荧光显微镜(QLS-scope,北京Quantum量子科学仪器贸易有限公司);酶联免疫吸附试验(ELISA)测定试剂盒(SHC-9823,上海淳麦生物科技有限公司);蛋白质裂解液(SH0441,上海齐一生物科技有限公司);十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒(01100031,北京兰杰柯科技有限公司);电化学发光(ECL)检测试剂盒(KFS099,北京百奥莱博科技有限公司);TLR4抗体(10146-T16)、GAPDH抗体(10094-MM09-50)均购于北京义翘神州科技股份有限公司。

1.2分组与模型制备 选取40只SPF级SD雄性大鼠随机分为正常(N)组、模型(M)组、针灸(A)组、西比灵(W)组,每组10只。对M、A、W组进行颈性眩晕建模,首先将大鼠固定,用0.4%的戊巴比妥麻醉后,剪断颈后部肌肉,切除包括棘上韧带、棘间韧带的C5-6 棘突和韧带,并破坏该段关节囊,使大鼠颈椎上下椎体出现明显失稳,然后逐层缝合伤口,手术完成后4万U青霉素连续注射3 d,当伤口愈合后,将大鼠放在平衡木上,如出现摇晃、停滞等现象时,则视为建模成功,N组不建立该模型,同期给予同体积生理盐水。建模成功后,A组选取“风池”“百会”等穴位进行针灸治疗,W组灌胃西比灵0.5 mg/kg,两组均1次/d,持续21 d,N、M组同期灌胃0.5 mg/kg生理盐水,给药期间观察各组一般情况并记录。

1.3检测步骤 (1)行为学检测:实验完成后对各组大鼠进行平衡木实验,首先将平衡木放置妥当,然后上下左右的转动大鼠头部,转动完成后迅速将大鼠放于平衡木上,若其在平衡木上摇晃、停滞、调转方向、稍有移动或不移动,计0～1分;有明显移动,甚者通过木杆,计1～2分;较流畅行走,通过木杆,计2～3分,总分3分,评分越高行为学恢复越好。(2)标本采集:平衡木实验完成后,麻醉后处死大鼠,腹主动脉取血5 ml,将其放入含肝素钠的真空采血管中,摇匀后静置2 h,离心15 min,弃掉上清液,得血浆样品放入冰箱密封保存,同时于冰上断头取脑,并分离出中缝背核组织,将其放于冷冻的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中保存备用,其余脑组织用4%的多聚甲醛固定96 h,洗涤后放入冰箱中密封保存。(3)中缝背核神经元细胞活性测定:取中缝背核组织,采用TUNEL试剂盒检测中缝背核神经元细胞凋亡,凋亡细胞发绿色荧光。(4)血浆血管活性物质相关指标水平测定:采用ELISA检测内皮素(ET)-1、血栓素(TX)B2、神经肽(NP)Y、降钙素基因相关肽(CGRP)水平,严格按照试剂盒说明操作。(5)大鼠脑组织中TLR4蛋白表达检测:另取20只大鼠,建模后随机分为两组,T组给予灌胃1 mg/kg TLR4抑制剂组,U组给予TLR4抑制剂联合针灸,Western印迹检测各组脑组织中NLR4蛋白,主要步骤为样品制备、蛋白质浓度测定、SDS-PAGE、转膜、阻断、一抗孵育、 洗涤、二抗孵育、再洗涤、信号检测及数据分析。

1.4统计学分析 采用GraphPad Prism8.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组一般情况观察结果 N组皮毛光泽,活动自如,一般情况均正常,对外界刺激也反应灵敏,M组皮毛光泽可见降低,且活动明显受限,颈部活动受限最为明显,进食、进水量明显减少,对外界刺激反应可见明显降低,而与M组相比,A、W组一般情况明显改善,饮食逐渐恢复正常,颈部活动也明显恢复。

2.2各组行为学结果 与N组相比,M组平衡木得分明显降低(P<0.05);与M组比较,A、W两组平衡木得分明显升高(P<0.05);W组与A组相比无明显差异(P>0.05),见表1。

2.3各组血浆中血管活性物质相关指标水平 与N组相比,M组血浆中CGRP水平明显降低,ET-1、TXB2、NPY水平明显升高(P<0.05);与M组比较,A、W两组血浆中CGRP水平明显升高,ET-1、TXB2、NPY水平明显降低(P<0.05);W组与A组相比无明显差异(P>0.05),见表1。

2.4各组中缝背核神经元细胞活性 与N组相比,M组中缝背核神经元细胞凋亡明显升高(P<0.05);与M组比较,A、W两组中缝背核神经元细胞凋亡明显降低(P<0.05);W组与A组相比无明显差异(P>0.05),见表1、图1。

表1 各组平衡木得分、中缝背核神经元细胞凋亡率、血浆中血管活性物质相关指标水平

图1 各组中缝背核神经元细胞活性(TUNEL染色,×200)

2.5各组脑组织中TLR4蛋白表达 与N组(1.21±0.05)相比,M组脑组织中TLR4蛋白表达(2.74±0.12)明显升高(P<0.05);与M组比较,A、W两组脑组织中TLR4蛋白表达(1.97±0.11,1.98±0.11)明显降低(P<0.05);W组与A组相比无明显差异(P>0.05);T组(1.96±0.11)与W组相比无明显差异(P>0.05);U组(1.41±0.09)比T组明显降低(P<0.05),见图2。

图2 各组脑组织中TLR4蛋白表达

3 讨 论

长时间的低头会导致颈椎受损从而引发各种颈椎病,这也使得颈椎病的发病率不断上涨且呈年轻化趋势〔8〕。而颈性眩晕除伴有颈项僵痛、麻木、耳鸣等症状,还伴有头晕目眩、恶心呕吐、步履不稳,同时其也是高血压、脑梗死等疾病的发病诱因,因此探寻一种有效地治疗方法对缓解患者病痛,预防并发症等方面具有积极意义〔9〕。古代医师在针灸治疗颈椎病方面留下了丰富的临床资料以供借鉴〔10〕。

本研究说明,针灸治疗具有显著疗效。西比灵是临床上治疗眩晕的常用药物,其可选择性的阻止过量钙离子进入细胞,从而防止血管痉挛,进而恢复椎动脉的供血,最终到达缓解眩晕症状的目的,因此本文选择其作为对照药物〔11〕。而针灸是一种传统的中医疗法,可以用于治疗各种疾病和症状,包括头晕,其通过刺激特定的穴位来调节人体的气血流动,促进身体的自愈能力〔12〕。平衡木实验是反映大鼠行为学的有效指标,其能够验证大鼠的平衡能力及眩晕状态,且操作简单易行,便于实验。颈性眩晕在中医中属于眩晕范畴,其主要病机为局部经脉气血运行不畅,髓海失养,难以上呈清窍而致,因此调整督脉气血、活血化瘀是关键所在〔13〕。对于颈性眩晕大鼠,针灸主要是通过刺激穴位及局部软组织,来激发经脉气血,从而调节血管的血流速度、调节局部软组织的紧张痉挛状态,进而改善椎动脉血供、缓解局部肌肉痉挛,最终有效改善或消除头晕症状。张国亮〔14〕研究发现,针灸治疗颈性眩晕具有良好的临床效果,可显著缓解眩晕症状,这与本文结果类似。

本研究表明,针灸可显著抑制颈性眩晕大鼠中缝背核神经元细胞活性,有效调控血管活性物质分泌。颈交感神经刺激学说是目前被医学专家公认的引起颈性眩晕的几大学说之一,当交感神经受到压迫或刺激时,就会引起眩晕、头痛、恶心、心脏搏动增快等情况,而中缝背核神经元细胞活性可能在其中发挥着重要作用〔15〕。血液中ET-1、TXB2、NPY、CGRP等血管活性物质与椎基底动脉供血有着密切的关联,有研究表明,血管活性物质分泌紊乱是诱发眩晕的关键因素〔16〕。颈椎长期受到压迫或椎动脉出现粥样硬化是颈性眩晕的主要致病因素,而这会导致血流减慢,从而引起缺血低氧反应,进而影响血管活性物质的分泌,最终加重疾病症状〔17〕。对于颈性眩晕大鼠,针灸可能是通过穴位刺激,来扩张血管,调节微循环,从而增加脑血流量及局部组织的微血流量、降低微血管收缩性、降低血管阻力、抑制血小板凝集,进而降低血黏度、松弛颈部肌肉痉挛、改善供血,最终有效改善颈性眩晕症状。刘乃刚等〔18〕研究发现,针灸治疗对第三腰椎横突综合征大鼠具有显著疗效,其可有效调节血浆中血管活性物质的含量,这与本文结果类似。

本研究说明,针灸可显著抑制TLR4炎症信号通路表达。TLR4 是一种模式识别受体,其在免疫炎症反应中发挥着不可或缺的作用,而其所在炎症信号通络也是炎症反应发生的重要参与者,其可通过活化促炎性因子来促进炎症反应〔19〕。颈性眩晕由于血流受到限制,从而激发了炎症反应,而相关炎症性的发生、发展与靶器官的损害是一个恶性循环,因此近年来如何抑制炎症反应是临床治疗该病的工作重点〔20〕。对于颈性眩晕大鼠,针灸可能是通过穴位这种外源性刺激,来激活机体神经-内分泌-免疫网络系统,将物理信号转化为生物信号,从而释放某些 TLR4的内源性配体使其与 TLR4结合,进而达到降低TLR4表达、抑制相关炎性因子分泌、促进细胞外基质合成等目的,最终有效抑制炎症反应,改善大鼠临床症状。孙远征等〔21〕研究发现,针刺可以调控TLR4-核因子-κB信号通路,在颈椎病等慢性神经退行性疾病中起调节作用,这与本文结果类似。

综上,针灸可显著抑制颈性眩晕大鼠中缝背核神经元细胞活性并有效调控血管活性物质水平,其作用机制可能与抑制TLR4炎症信号通路有关。