复方黄柏液调节NF-κB/MAPK信号通路对皮肤溃疡大鼠炎症反应的影响

蒋晓蕾 朱立宏

(武汉市中医医院中医皮肤科,湖北 武汉 430014)

皮肤溃疡病因复杂、病程较长、且易反复发作,严重影响患者生活及工作〔1〕。近来研究发现,皮肤持续的炎症反应,是导致新生结缔组织改建失败、表皮细胞爬行困难,创面愈合减慢的主要原因〔2〕。中医药在抗炎、促进创面愈合方面有潜在疗效〔3〕。复方黄柏液具有消肿化腐、清热解毒、抗炎、抗菌等作用,近来临床研究发现其可有效控制炎症,治疗慢性创面愈合不良有效率达70.37%〔4〕,预示其在皮肤溃疡治疗方面有潜在价值,但其促进皮肤创面愈合的分子机制还不甚清楚。核转录因子(NF)-κB被称为炎症调控的开关,其转录入核活化可促进炎症因子转录释放〔5〕。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)可将胞外炎症信号传递到胞内,并诱导成纤维细胞、内皮细胞、表皮细胞等增殖、分化后向伤口处运动,刺激多种生长因子分泌,来促进肉芽新生及溃疡愈合〔6〕。本研究从NF-κB/MAPK通路探究复方黄柏液对皮肤溃疡大鼠炎症反应的影响。

1 材料和方法

1.1实验材料 SPF级雄性SD大鼠90只,7周龄,体质量200～220 g,购自中国医学科学院医学实验动物研究所;生产许可证号:SCXK(京)2021-0004。本试验符合3R原则并经本院伦理委员会批准ICAU-20210908112。复方黄柏液(含连翘、黄柏、金银花、蒲公英、蜈蚣成分,货号:202106140003,购自山东汉方制药有限公司,规格100 ml);NF-κB阻断剂吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(PDTC,货号:GJ50622,上海圻明生物科技有限公司);MAPK阻断剂(SB203580,货号:S1076,美国MCE公司);苏木素-伊红(HE)染色液(货号:YT8310,北京伊塔生物科技有限公司);NF-κB磷酸化蛋白(p-NF-κB)、MAPK磷酸化蛋白(p-MAPK)、NF-κB、MAPK、丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶(MKP)-1、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、转分化生长因子(TGF)-β抗体均购自美国abcam公司。

1.2模型建立及分组 取SD大鼠,参照文献〔7〕剃去背部面积4 cm×4 cm的长毛,无菌条件下剪去皮肤,深达筋膜,股肌注射氢化可的松注射液(60 mg/kg),并于筋膜下喷洒金黄色葡萄球菌(1 ml/只),医用纱布覆盖创面,橡皮膏包扎固定,并随机分为:模型组、复方黄柏液组、NF-κB阻断剂组、MAPK阻断剂组、复方黄柏液+MAPK阻断剂组,每组15只。另取15只大鼠,仅在相应部位将皮瓣分离,原位缝合作为假手术组。各组均于造模手术后第2天开始给药,复方黄柏液组参照文献〔8〕用盐水棉球清洁创面后,用与创面相仿的无菌纱布覆盖创面,无菌注射器抽取药液(约3 ml)注于纱布内,以纱布浸透,药液未溢出为度,透明薄膜敷贴包扎后无菌纱布包裹固定,每天换药2次;NF-κB阻断剂组及MAPK阻断剂组参照文献〔9〕分别经腹腔注射PDTC 120 mg/kg及SB203580 10 mg/kg进行干预治疗,1次/d;复方黄柏液+MAPK阻断剂组腹腔注射SB203580 10 mg/kg的同时,给予复方黄柏液进行干预治疗;模型组用无菌纱布浸透生理盐水后包裹固定创面。各组连续给药4 w。

1.3溃疡面积及创面愈合率检测 各组给药结束后,卡尺测量溃疡面积;用透明膜覆创面画膜、剪膜,并换算成面积,计算创面愈合率,创面愈合率=(给药前创面面积-未愈合创面面积)/给药前创面面积×100%。

1.4HE染色观察创面病理变化 肉眼观察创面形态,随机取6只大鼠,麻醉处死后,取创面,置于多聚甲醛溶液固定24 h,制成厚为5 μm的石蜡切片,置于光镜下观察组织形态变化。

1.5免疫组化法检测p-NF-κB、p-MAPK阳性表达 取创面石蜡切片,脱蜡、透化、抗原修复后,滴加1∶100的兔抗大鼠p-NF-κB、p-MAPK一抗抗体孵育24 h,滴加山羊抗兔IgG(1∶400)二抗抗体孵育20 min,二氨基联苯胺(DAB)显色,光镜下观察拍照,Image-Pro Plus6.0软件分析单位面积内阳性染色的平均光密度值(MD)。

1.6酶联免疫吸附试验(ELISA)检测创面组织炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-8水平 剩余9只大鼠,处死后取创面组织,粉碎匀浆后取匀浆液,按ELISA试剂盒说明书方法检测TNF-α、IL-1β、IL-8水平。

1.7Western印迹检测创面组织蛋白表达 取创面组织匀浆液,提取胞质及胞核蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白浓度,取40 μg蛋白行电泳、转膜操作,滴加1∶600的兔抗大鼠NF-κB、p-NF-κB、MAPK、p-MAPK、MKP-1、VEGF、bFGF、TGF-β一抗及1∶900的内参β-actin抗体孵育24 h,滴加山羊抗兔IgG二抗(1∶1 500)孵育45 min,增强化学发光液显色,ImageJ软件分析条带灰度值。

1.8统计学分析 采用SPSS24.0软件进行t检验、方差分析,组间多重比较用SNK-q检验。

2 结 果

2.1复方黄柏液对大鼠溃疡面积及创面愈合率的影响 与假手术组相比,模型组溃疡面积明显升高,创面愈合率明显降低(P<0.05)。与模型组相比,复方黄柏液组及NF-κB阻断剂组溃疡面积明显减小,创面愈合率明显升高(P<0.05);MAPK阻断剂组溃疡面积明显增大,创面愈合率明显降低(均P<0.05)。与复方黄柏液组相比,MAPK阻断剂组、复方黄柏液+MAPK阻断剂组溃疡面积明显增大,创面愈合率明显降低(均P<0.05),见表1。

表1 各组溃疡面积及创面愈合率比较

2.2复方黄柏液对大鼠创面组织病理变化的影响 肉眼可见假手术组创面肉芽组织、纤维排列整齐,筋膜内有丰富的毛细血管网;模型组创面有大量渗出液,气味腥臭,创面颜色晦暗,筋膜内毛细血管网稀少。复方黄柏液组及NF-κB阻断剂组创面渗出液减少,创面颜色鲜红,肉芽组织及毛细血管网形成较多。MAPK阻断剂组渗出液较模型组增多,筋膜内几乎未见毛细血管网。复方黄柏液+MAPK阻断剂组创面渗出液及颜色变化较模型组相近。

HE染色可见,假手术组创面有表皮新生且结构完整,表皮层下可见成纤维细胞及胶原纤维增多、炎性细胞散在分布,毛细血管丰富;模型组及复方黄柏液+MAPK阻断剂组创面虽有新生表皮,但未覆盖创面,表皮上有痂皮,炎性细胞聚集增多,痂皮下组织液增多,真皮层中毛细血管和胶原纤维较少。复方黄柏液组及NF-κB阻断剂组创面有角质层、棘层和基底层新生,成纤维细胞和炎性细胞散在分布于基底层下,毛细血管丰富且胶原纤维较多,但形状较细,没有交织成网。MAPK阻断剂组创面组织液形成的痂皮中炎性细胞聚集增多,毛细血管和胶原纤维形成最少,见图1。

图1 各组创面组织(HE染色,×100)

2.3复方黄柏液对大鼠创面组织p-NF-κB及p-MAPK阳性表达的影响 免疫组化染色可见假手术组创面组织p-NF-κB阳性(红棕色)表达较浅,p-MAPK阳性表达加深。与假手术组相比,模型组p-NF-κB阳性表达明显升高,p-MAPK阳性表达明显降低(P<0.05)。与模型组相比,复方黄柏液组及NF-κB阻断剂组p-NF-κB阳性表达明显降低,p-MAPK阳性表达升高;MAPK阻断剂组p-NF-κB阳性表达明显升高,p-MAPK阳性表达明显降低(均P<0.05)。与复方黄柏液组相比,MAPK阻断剂组、复方黄柏液+MAPK阻断剂组p-NF-κB阳性表达明显升高,p-MAPK阳性表达明显降低(P<0.05),见图2、表2。

图2 各组创面组织p-NF-κB及p-MAPK(免疫组化染色,×400)

2.4复方黄柏液对大鼠创面组织炎症因子表达的影响 与假手术组相比,模型组创面组织TNF-α、IL-1β、IL-8表达明显升高(P<0.05)。与模型组相比,复方黄柏液组及NF-κB阻断剂组创面组织TNF-α、IL-1β、IL-8表达明显降低;MAPK阻断剂组创面组织TNF-α、IL-1β、IL-8表达明显升高(均P<0.05)。与复方黄柏液组相比,复方黄柏液+MAPK阻断剂组、MAPK阻断剂组创面组织TNF-α、IL-1β、IL-8表达明显升高(P<0.05),见表2。

表2 各组创面组织p-NF-κB及p-MAPK阳性表达、TNF-α、IL-1β、IL-8表达比较

2.5复方黄柏液对大鼠创面组织NF-κB及MAPK通路蛋白、生长因子蛋白表达的影响 与假手术组相比,模型组创面组织p-NF-κB/NF-κB、MKP-1蛋白表达明显升高,p-MAPK/MAPK、VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表达明显降低(均P<0.05)。与模型组相比,复方黄柏液组及NF-κB阻断剂组创面组织p-NF-κB/NF-κB、MKP-1蛋白表达明显降低,p-MAPK/MAPK、VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表达明显升高;MAPK阻断剂组创面组织p-NF-κB/NF-κB、MKP-1蛋白表达明显升高,p-MAPK/MAPK、VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表达明显降低(均P<0.05)。与复方黄柏液组相比,MAPK阻断剂组、复方黄柏液+MAPK阻断剂组p-NF-κB/NF-κB、MKP-1蛋白表达明显升高,p-MAPK/MAPK、VEGF、bFGF、TGF-β蛋白明显降低(均P<0.05)。见表3、图3。

表3 各组创面组织各蛋白表达比较

1～6:假手术组、模型组、复方黄柏液组、NF-κB阻断剂组、MAPK阻断剂组、复方黄柏液+MAPK阻断剂组图3 各组创面组织p-NF-κB、NF-κB、MKP-1、p-MAPK、MAPK、VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表达

3 讨 论

皮肤溃疡后创面修复及愈合困难是临床的一大难题〔10〕。研究发现,创面愈合涉及炎症反应、肉芽组织形成、新生结缔组织沉积及改建等3个过程〔11〕。其中炎症反应过程是创面正常愈合的第一个也是非常重要的阶段,其可溶解及清除坏死组织及渗出物,为肉芽组织形成奠定基础,但炎症反应过激,也会杀伤正常细胞,降解结缔组织中的胶原,而不利于创面愈合〔12〕。Panek-Jeziorna等〔13〕发现,慢性难愈合性皮肤溃疡患者渗出液或血清中存在IL-1β、IL-8、TNF-α等炎症因子释放增多现象,提示炎症反应过激,可能是皮肤溃疡后愈合速度减慢的关键因素。

已有研究发现,抑制炎症因子大量释放及渗入周围组织,可加快肉芽组织形成,促进溃疡愈合〔14〕。复方黄柏液是由黄柏、连翘、金银花、蒲公英等药物组成,具有清热解毒、祛腐生肌、杀菌止痒等功效,因其具有抗菌、抗感染、抗炎、促伤口愈合等药理作用,而被应用于湿疹、痤疮、带状疱疹等皮肤病的治疗〔15〕。李友山等〔16〕临床研究,发现复方黄柏液可促进糖尿病足部溃疡患者TNF-α及IL-1等炎症因子的释放,升高VEGF及表皮生长因子(EGF)表达而促进溃疡愈合,提示复方黄柏液可能为治疗皮肤溃疡的潜在药物。本研究结果证实,复方黄柏液可促进溃疡愈合。

NF-κB被称为炎症的总开关,其磷酸化入核活化,可诱导IL-1β、IL-8、TNF-α等炎症因子的转录及表达,而介导炎症信号的传导,并能诱导T细胞、树突状细胞表达MKP-1来吞噬受损或感染细菌的细胞〔17〕。但MKP-1同时也是MAPK的负性调节因子,可通过去磷酸化作用,使p-MAPK活性失活〔18〕。MAPK磷酸化活性升高已被证实可促进生长因子如VEGF、bFGF、TGF-β等表达来诱导血管新生、肉芽组织形成及表皮再生修复〔19,20〕。李多等〔21〕研究发现复方黄柏液可通过抑制p-NF-κB表达来降低溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜炎症损伤。本研究结果提示,复方黄柏液促进皮肤溃疡愈合作用,可能与抑制NF-κB介导的炎症反应活化,升高MAPK磷酸化活化介导的生长因子表达有关。MAPK阻断剂可部分减弱复方黄柏液发挥的抗炎、促生长因子表达及抗溃疡等作用。

综上,NF-κB与MAPK之间的联系较为复杂且争议较多。复方黄柏液通过何种途径调控NF-κB炎症及MAPK促生长因子表达,发挥抗溃疡作用,还需进一步探讨及验证。