小鼠骨髓和脂肪间充质干细胞定向分化能力的比较研究

钟家帅 冯玉梅

摘要：目的 探討小鼠骨髓源性间充质干细胞（BM-MSCs）和脂肪源性间充质干细胞（AD-MSCs）的定向分化能力。方法 从C57BL/6J小鼠股骨骨髓和腹股沟白色脂肪组织中分别分离和培养BM-MSCs和AD-MSCs，分别使用成骨、成软骨和成脂诱导分化培养基诱导两种细胞定向分化。采用茜素红、阿利新蓝和油红O染色检测成骨、成软骨和成脂分化程度；实时荧光定量PCR（qPCR）鉴定MSCs并检测定向分化相关基因Runx2、Sp7（成骨），Sox9、Col2a1（成软骨），Pparg和Cebpa（成脂）表达水平，确定细胞的定向分化能力。基于GEO数据库中GSE43804和GSE122778数据集的小鼠和人类BM-MSCs和AD-MSCs基因表达谱数据，分析差异表达基因及其富集的信号通路。结果 分离培养得到的BM-MSCs和AD-MSCs细胞形态不同，AD-MSCs梭形形态更明显；两种细胞均表达CD29、CD44和CD90，不表达CD34和CD45。定向诱导后AD-MSCs的成骨和成脂分化程度高于BM-MSCs，而成软骨分化程度低于BM-MSCs（P＜0.05）；定向诱导后AD-MSCs中Runx2、Pparg和Cebpa mRNA表达水平高于BM-MSCs，Sox9 mRNA表达水平低于BM-MSCs（P＜0.05）。小鼠和人的AD-MSCs高表达的基因富集于PPAR和WNT信号通路，BM-MSCs高表达的基因富集于软骨和骨发育信号通路。结论 小鼠AD-MSCs成骨和成脂分化能力强于BM-MSCs，而成软骨分化能力弱于BM-MSCs，PPAR、WNT、软骨和骨发育信号通路的活化状态在决定BM-MSCs和AD-MSCs不同定向分化潜能中起重要调节作用。

关键词：间质干细胞；骨髓；脂肪类；PPARγ；Wnt信号通路；成骨分化；成软骨分化；成脂分化

中图分类号：R329.24文献标志码：ADOI：10.11958/20230437

Comparative study on the directed differentiation ability of mouse bone marrow and adipose-derived mesenchymal stem cells

Abstract： Objective To investigate the targeted differentiation ability of mouse bone marrow derived mesenchymal stem cells （BM-MSCs） and adipose-derived mesenchymal stem cells （AD-MSCs）. Methods BM-MSCs and AD-MSCs were isolated and cultured from bone marrow of femur and white adipose tissue of groin of C57BL/6J mice respectively， and the two types of cells were induced by osteogenic， chondrogenic and adipogenic differentiation medium respectively. Alizarin red， alcian blue and oil red O staining were used to detect the differentiated degree of osteogenic， chondrogenic and lipogenic differentiation. Real-time fluorescence quantitative PCR （qPCR） was used to identify MSCs and detected expression levels of directed differentiation-related genes Runx2， Sp7 （osteoblast）， Sox9， Col2a1 （chondroblast）， Pparg and Cebpa （lipogenesis） to determine the directed differentiation ability of cells. Based on gene expression profiles of mouse and human BM-MSCs and AD-MSCs in GEO database GSE43804 and GSE122778， the differentially expressed genes and their enrichment signal pathways were analyzed. Results The cell morphology of BM-MSCs and AD-MSCs obtained by isolation and culture was different， and spindle-shaped morphology was more obvious in AD-MSCs. Both cells expressed CD29， CD44 and CD90， but did not express CD34 and CD45. AD-MSCs showed higher osteogenic and lipogenic differentiation than those of BM-MSCs after directed induction， while chondrogenic differentiation was lower in AD-MSCs than that of BM-MSCs （P＜0.05）. After directional induction， expression levels of Runx2， Pparg and Cebpa mRNA were higher in AD-MSCs than those in BM-MSCs， and Sox9 mRNA expression levels were lower than those in BM-MSCs （P＜0.05）. Highly expressed genes of AD-MSCs in mice and human were enriched in PPAR and WNT signaling pathways. Highly expressed genes of BM-MSCs were enriched in cartilage and bone developmental signaling pathways. Conclusion The osteogenic and adipogenic differentiation ability of mouse AD-MSCs is stronger than those of BM-MSCs， while the chondrogenic differentiation ability AD-MSCs is weaker than that of BM-MSCs. The activation status of PPAR， WNT， cartilages and skeletal system development signaling pathways plays an important regulatory role in determining the different directional differentiation potential of AD-MSCs and BM-MSCs.

Key words： mesenchymal stem cells; bone marrow; fats; PPAR gamma; Wnt signaling pathway; osteogenic differentiation; chondrogenic differentiation; adipogenic differentiation

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是胚胎发育期间产生于中胚层的具有多谱系分化潜能和自我更新能力的成体干细胞，可分化为中胚层起源的所有细胞类型，如骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等。MSCs广泛存在于骨髓和脂肪等成体组织和器官中［1］，根据其多谱系分化潜能以及通过趋化迁移到损伤部位的能力用于再生医学和肿瘤靶向治疗［2］。骨髓源性间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BM-MSCs）和脂肪源性间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs）可分别在机体骨髓基质和脂肪组织基质中分离和培养，并均可在定向诱导条件下分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等多种细胞类型［3-5］，是组织修复和再生医学领域应用较多的MSCs［6-8］。但BM-MSCs与AD-MSCs向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞定向分化能力的差异和机制尚不明确。本研究通过定向诱导分化实验比较小鼠BM-MSCs和AD-MSCs向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞定向分化能力的差异，并通过小鼠和人类BM-MSCs和AD-MSCs基因表达谱差异表达基因及其富集的信号通路分析潜在的分子机制，以期为BM-MSCs和AD-MSCs的应用提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6周龄的C57BL/6J雄鼠购于赛业（苏州）生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（苏）2022-0016，使用许可证号：SYXK（津）2023-0001。小鼠饲养于天津医科大学肿瘤医院SPF级实验动物中心，环境温度20～26 ℃，昼夜温差≤4 ℃，相对湿度40%～70%，12 h交替明暗灯光。本研究通过天津医科大学肿瘤医院实验动物伦理委员会审查（伦理编号：AE-2022034），依据动物伦理与福利的相关规定实施。

1.2 试剂和仪器 DMEM培养基、胎牛血清（FBS）购于Gibco公司；Ⅰ型胶原酶和Trizol试剂购于ThermoFisher公司；胰蛋白酶-EDTA、青霉素、链霉素和SuperScriptTM Ⅱ逆转录试剂盒购于Invitrogen公司；胰岛素购于Selleckchem公司；抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、胰岛素-转铁蛋白-硒、阿利新蓝染色液购于Sigma公司；地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚美辛购于MCE公司；油红O染色液和1%茜素红染色液购于Solarbio公司；2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂购于Vazyme公司。倒置显微镜Axio Observe购于Zeiss公司；Alpha UnitTM Block Assembly for PTC DNA EngineTM Systems PCR仪购于MJ Research公司；7500 Real-time PCR仪购于Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 BM-MSCs和AD-MSCs的分离和培养 颈椎脱臼法处死小鼠，将其置于75%乙醇中浸泡15 min。在无菌条件下分离小鼠双下肢和腹股沟区白色脂肪组织。（1）BM-MSCs的分离。取股骨并剔除肌肉组织与筋膜，剪去长骨两端，使用1 mL注射器针头吸取含10%灭活FBS和1%青-链霉素的DMEM培养基反复冲洗骨髓腔。骨髓悬液在37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养。24 h后换液，继续培养贴壁。（2）AD-MSCs的分离。将脂肪组织剪碎至1 mm3大小，加入4.5 mL含1%青-链霉素的PBS，500 μL的Ⅰ型胶原酶（10 g/L），37 ℃消化1 h，加入含10%灭活FBS和1%青-链霉素的DMEM培养基终止消化。1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，用DMEM培养液重悬细胞，40 μm滤网过滤后再次离心，重悬细胞后吹打均匀。将其接种至培养皿，在37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养。24 h后换液，继续培养至细胞贴壁。BM-MSCs和AD-MSCs置于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱内常规传代培养，定期观察细胞形态，使用P2或P3代细胞进行后续实验。见图1。

1.3.2 MSCs的诱导分化 将BM-MSCs、AD-MSCs分别接种于12孔板中（每孔2×104个细胞）。BM-MSCs、AD-MSCs先用含10%灭活FBS和1%青-链霉素的DMEM培养基培养，待细胞融合度约50%时，分别用成骨分化条件培养基（DMEM培养基中添加10%未灭活FBS、50 mg/L抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10 nmol/L地塞米松和1%青-链霉素）、成软骨分化条件培养基（DMEM培养基中添加10%未灭活FBS、100 nmol/L地塞米松、50 nmol/L抗坏血酸、6.5 mg/L胰岛素、50 nmol/L转铁蛋白-硒和1%青-链霉素）和成脂分化条件培养基（DMEM培养基中添加10%未灭活FBS、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、100 μmol/L吲哚美辛、1 μmol/L地塞米松，10 μmol/L胰岛素、1%青-链霉素）替换生长培养基进行定向诱导分化，每2～3 d更换培养基，分化期间细胞置于5%CO2、37 ℃恒温培养箱培养。成骨和成软骨分化21 d终止，成脂分化25 d终止。

1.3.3 染色鉴定MSCs分化程度 定向诱导分化结束后，对2组MSCs细胞进行染色鉴定。弃掉培养液，用PBS清洗3次，4%多聚甲醛在室温下固定30 min，蒸馏水清洗3次。1%茜素红染色2～3 min鉴定诱导成骨MSCs的分化程度；1%阿利新蓝染色15 min鉴定诱导成软骨MSCs的分化程度；油红O染色液染色15 min鉴定诱导成脂MSCs的分化程度（油红O染前使用60%异丙醇浸洗细胞表面1 min，然使用异丙醇浸洗细胞表面2～3次，使间质清晰），蒸馏水清洗3次。倒置显微镜下观察细胞形态，统计每组5个视野中平均钙结节数、阿利新蓝阳性细胞比例和油红O阳性细胞比例以判断诱导成骨、成软骨和成脂分化程度。

1.3.4 逆转录-实时荧光定量PCR（qRT-qPCR）鉴定MSCs并检测定向分化相关基因表达水平 取定向诱导分化前和分化后的BM-MSCs和AD-MSCs，Trizol提取RNA，使用SuperScriptTMⅡ试剂盒配制逆转录反应体系：RNA 10 μL、Oligo（dT）1 μL、dNTP 4 μL、10×Buffer 2 μL、MMLV逆转录酶1 μL和RNase 1 μL，DEPC水补至20 μL。将其置于PCR仪中逆转录，反应条件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。以cDNA为模板，使用SYBR Mix试剂盒配制反应体系：SYBR Mix 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，cDNA 1 μL，无核酸水补至20 μL。反應条件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，进行40个循环；检测CD29、CD44，CD90、CD34和CD45 mRNA表达水平以鉴定MSCs；检测成骨分化标志基因：Runt相关转录因子2（Runx2）和Sp7；成软骨分化标志基因：SRY-box转录因子（Sox9）和Ⅱ型α1胶原蛋白（Col2a1）；成脂分化标志基因：过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Pparg）和CCAAT增强子结合蛋白α（Cebpa）的表达水平。所有引物序列均在NCBI数据库中利用Primer-Blast设计，经Blast数据库核酸序列比对无误后，由北京生工工程有限生物公司合成，序列见表1。以样本中的Gapdh mRNA表达水平作为内参，依据公式ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，后计算2-ΔCt值以表示目的基因的相对表达水平。

1.3.5 MSCs基因表达谱分析 鼠源BM-MSCs（mBM-MSCs）和鼠源AD-MSCs（mAD-MSCs）基因表达谱数据集（GSE43804）来自公开发表的GEO数据库，包括3只8周龄朋友病毒B型（friend virus B-type，FVB）背景小鼠股骨骨髓和腹股沟白色脂肪的BM-MSCs和AD-MSCs全基因组基因表达谱数据（n=3）。人源BM-MSCs（hBM-MSCs）和人源AD-MSCs（hAD-MSCs）基因表达谱数据集（GSE122778）中包括来自14名健康志愿者骨髓和白色脂肪的BM-MSCs和AD-MSCs全基因组基因表达谱数据。所有数据归一化处理，筛选Log2 fold change（LogFC）＞1且P＜0.05的表达差异基因，绘制带基因标注的火山散点图。GO数据库富集分析鼠源和人源MSCs不同组织部位中的差异基因。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行数据分析，实验数据均以[[x] ±s

]表示，2组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MSCs的鉴定和细胞形态的比较 分离培养3 d时，BM-MSCs组中造血系细胞较多（圆形细胞），AD-MSCs中较少。6 d内3次换液后，造血系细胞几乎全部脱落，MSCs纯化完成。培养至7 d时，2种MSCs均呈纺锤状，但AD-MSCs较修长，梭形更明显，见图2。qRT-PCR结果显示BM-MSCs和AD-MSCs表达CD29、CD44和CD90，不表达CD34和CD45，见表2。

2.2 BM-MSCs和AD-MSCs成软骨、成骨和成脂分化程度比较 茜素红染色结果显示，AD-MSCs组钙结节数（个/视野）多于BM-MSCs组（8±1 vs. 4±1，n=3，t=4.472，P＜0.05），见图3。阿利新蓝染色结果显示，AD-MSCs组阿利新蓝阳性细胞比例（%）低于BM-MSCs组（63.82±6.68 vs. 83.42±9.88，n=3，t=3.408，P＜0.05），见图4。油红O染色结果显示，AD-MSCs组油红O阳性细胞比例（%）高于BM-MSCs组（71.26±9.97 vs. 32.93±10.31，n=3，t=4.111，P＜0.05），见图5。

2.3 定向诱导分化前后BM-MSCs和AD-MSCs的标志基因表达水平 2种MSCs定向成骨分化，诱导分化前，AD-MSCs组Sp7 mRNA表达水平低于BM-MSCs组（P＜0.05），而诱导后AD-MSCs组中Runx2 mRNA表达水平高于BM-MSCs组（P＜0.05）；定向诱导成软骨分化前后，BM-MSCs中Sox9 mRNA表达水平均高于AD-MSCs组（P＜0.05）；成脂分化后，AD-MSCs组中Pparg和Cebpa mRNA水平高于BM-MSCs组（P＜0.05），而分化前无明显差异。见表3—5。

2.4 BM-MSCs与AD-MSCs基因表达差异比较 小鼠和人类2种不同组织来源MSCs的分化相关基因有类似的差异水平。如图6所示，筛选鼠源和人源两种组织来源的MSCs共同的差异表达基因，基因表达谱数据显示，在mBM-MSCs和hBM-MSCs中，Runx2、Sp7、Sox9、Col2a1、蛋白聚糖（Acan）、无翼型MMTV结合位点家族配体5a（Wnt5a）、SRX-Box转录因子11（Sox11）和纤连蛋白（Fn1）等基因高表达，而在mAD-MSCs和hAD-MSCs中Pparg、Cebpa、脂肪酸结合蛋白5（Fabp5）、Wnt2b、Wnt4、卷曲类受体4（Fzd4）和分泌型卷曲类受体2（Sfrp2）等基因低表达。GO富集分析显示鼠源和人源BM-MSCs高表达的基因均富集到软骨和骨发育系统信号通路，而AD-MSCs高表达的基因均富集到PPAR信号通路和利于成骨的WNT信号通路，见图7、8。

3 讨论

体外分离和培养BM-MSCs和AD-MSCs是MSCs用于骨和软骨组织修复和再生的最常用方法［3-5］，但BM-MSCs和AD-MSCs的定向分化能力的差异及其机制尚待深入研究。本研究从C57BL/6J小鼠股骨骨髓和腹股沟白色脂肪组织中分别分离和培养BM-MSCs和AD-MSCs，分别使用成骨、成软骨和成脂诱导分化培养基诱导2种细胞定向分化，发现定向诱导AD-MSCs的成骨和成脂分化程度高于BM-MSCs，而成软骨分化程度低于BM-MSCs。

Huang等［9］对比FVB小鼠来源的mAD-MSCs和mBM-MSCs诱导成骨分化的能力，结果显示AD-MSCs的成骨分化率高于BM-MSCs。Stukel等［10］诱导人类的BM-MSCs和AD-MSCs成骨分化，发现两者具有相似的碱性磷酸酶活性，但在自适配形状记忆聚合物支架上，在成骨培养基中只有使用AD-MSCs培养的支架在细胞培养和成骨分化21 d后硬度和局部模量比空白支架增加，且对骨缺损的治疗效果表现最好。Grottkau等［11］诱导大鼠来源的BM-MSCs与AD-MSCs成骨分化48 h，BM-MSCs和AD-MSCs中Sp7和Runx2 mRNA的表达水平均显著上调，而骨钙素mRNA的表达水平仅在AD-MSCs中显著上调，骨形態发生蛋白（BMP）2 mRNA在BM-MSCs中的上调速度明显慢于AD-MSCs，表明AD-MSCs比BM-MSCs更有成骨分化潜能。Hiwatashi等［12］研究发现，比格犬来源的AD-MSCs在修复瘢痕过程中产生的胶原蛋白密度较BM-MSCs组低，提示AD-MSCs成软骨能力较BM-MSCs弱。然而，Mohamed-Ahmed等［3，13］比较hBM-MSCs和hAD-MSCs在大鼠颅骨缺损支架上的骨再生能力，结果表明hBM-MSCs的碱性磷酸酶活性高于hAD-MSCs，hBM-MSCs支架比hAD-MSCs支架具有更高的细胞活性，骨再生速度比hAD-MSCs快。Hayashi等［14］通过体外培养和体内植入实验比较大鼠来源的BM-MSCs和AD-MSCs的成骨分化能力，结果显示BM-MSCs具有更强的成骨分化能力。

由上述相关研究可知，目前对于BM-MSCs和AD-MSCs的定向分化潜能比较研究的结论并不一致。笔者推测BM-MSCs与AD-MSCs分化能力差异的不确定性与MSCs分化过程中启动的多个信号通路的调控有关，于是通过小鼠与人类MSCs基因表达谱的数据分析了造成这种差异的潜在分子机制。MSCs向特定细胞类型的分化受多种细胞因子、生长因子、细胞外基质分子和转录因子等的控制［15］。在MSCs向骨细胞分化过程中起关键作用的主要转录因子是Runx2和Sp7［16］。本研究诱导分化前mAD-MSCs中Sp7 mRNA表达水平低于mBM-MSCs，但成骨分化能力强于mBM-MSCs，笔者推测在成骨分化过程中，影响细胞干性的Wnt信号通路在AD-MSCs中被高度激活，大量Wnt配体的产生增强了AD-MSCs的细胞干性，提高了其成骨分化的能力。Su等［17］通过生物信息学分析C57BL/6J小鼠来源mBM-MSCs和mAD-MSCs在成骨潜能方面的差异，结果表明Wnt和BMP信号在mBM-MSCs和mAD-MSCs的成骨分化过程中被差异激活，mBM-MSCs和mAD-MSCs通过不同的信号通路促进成骨分化，可能是造成2种MSCs成骨分化潜能差异的分子机制。Sox9通过控制胶原蛋白的表达，调控MSCs的软骨分化过程［18］。本研究中2种MSCs的Col2a1 mRNA表达水平无显著差异，笔者推测BM-MSCs和AD-MSCs的成软骨分化能力的不同是由于Sox9差异调控了其他胶原蛋白表达而非Col2a1。Pparg是调节MSCs成脂分化过程中重要的转录因子，抑制Pparg和Cebpa的表达可抑制脂肪的形成［19］。本研究中诱导分化后Pparg和Cebpa mRNA的表达差异证明了2种MSCs的定向分化能力不同，而分化前Pparg和Cebpa mRNA在2种MSCs中被差异激活，这可能是造成2种MSCs定向分化能力差异的分子机制。

基于对小鼠和人类BM-MSCs和AD-MSCs基因表达谱数据的分析，笔者发现除了本文重点检测的定向诱导分化相关的标志基因外，在mBM-MSCs和hBM-MSCs中共同高表达的基因Acan、Sox11和Fn1是常被报道为调控MSCs成软骨分化的细胞因子［18］，而Wnt5a则作为Wnt信号通路配体调控MSCs的成骨分化过程［15］。mAD-MSCs和hAD-MSCs中高表达基因Fabp5属于PPARγ信号通路中分泌蛋白的一种，参与脂肪酸结合和转运过程，调控MSCs成脂分化过程［19］，而Wnt2b、Wnt4、Fzd4和Sfrp2都是Wnt信号通路中的配体，参与调控成骨分化过程［15］。这些差异表明无论鼠源还是人源BM-MSCs都有更强的成软骨分化潜能，而AD-MSCs有更强的成脂分化潜能。AD-MSCs高表达的基因富集于PPAR和WNT信号通路，BM-MSCs高表达的基因富集于软骨和骨发育信号通路。这说明PPAR、WNT、软骨和骨发育信号通路表达水平不同导致了BM-MSCs和AD-MSCs定向分化潜能的差异。

综上所述，本研究证明小鼠AD-MSCs具有更强的成骨、成脂分化能力，BM-MSCs具有更强的成软骨分化能力，随着未来对MSCs与分化关系的深入研究，将会为BM-MSCs和AD-MSCs的临床应用提供更为准确深刻的实验和理论依据。

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