miR-10b靶向TGFBR1/SMAD3通路对特发性矮小症的软骨细胞增殖、肥大的影响机制

胡娜 李正宇 叶春风 吴英 姚庆 黄世祥 李文 朱海琴

摘要：目的 研究miR-10b對特发性矮小症（ISS）的影响及作用机制。方法 收集ISS患儿（ISS组）和体检健康儿童（健康对照组）各54例，qPCR检验血清miR-10b表达量，分析ISS组患儿血清miR-10b表达与患儿临床资料的关系。采用miR-10b inhibitor、si-TGFBR1及各自阴性对照转染C28/I2细胞，利用CCK-8实验检测C28/I2细胞增殖能力，Western blot检测侏儒相关转录因子2（RUNX2）、X型胶原α1链（COL10A1）、转化生长因子β受体1（TGFBR1）、SMAD3、pSMAD3蛋白表达量。在StarBase数据库筛选miR-10b靶点，利用双萤光素酶报告基因实验验证miR-10b与TGFBR1的靶向关系。结果 ISS组血清miR-10b表达量高于健康对照组，且miR-10b表达越高，患儿的身高、IGF-1、骨特异性碱性磷酸酶的下降越明显（P＜0.05）。与NC组相比，miR-10b inhibitor组细胞增殖能力升高，RUNX2、COL10A1、TGFBR1、pSMAD3蛋白表达上调（P＜0.05）；StarBase数据库提示miR-10b存在TGFBR1的结合位点，双萤光素酶报告基因实验证实两者结合。与si-NC相比，si-TGFBR1组TGFBR1表达量下调，细胞增殖能力下降（P＜0.05）。结论 miR-10b通过靶向TGFBR1/SMAD3通路在特发性矮小症中抑制软骨细胞的增殖、肥大。

关键词：特发性矮小症；受体，转化生长因子βⅠ型；miR-10b；Smad3蛋白质

中图分类号：R752.8文献标志码：ADOI：10.11958/20230659

The mechanism of miR-10b targeting TGFBR1/SMAD3 pathway on chondrocyte proliferation and hypertrophy in idiopathic short stature

Abstract： Objective To investigate the effect and mechanism of microRNA-10b （miR-10b） on idiopathic short stature （ISS）. Methods A total of 54 children with ISS and 54 healthy children were collected. The serum expression of miR-10b was detected by RT-qPCR， and the relationship between serum miR-10b expression and clinical data of children with ISS was analyzed. miR-10b inhibitor， si-TGFBR1 and their negative control transfection C28/I2 cells were used. CCK-8 experimental detection was used to detect C28/I2 cell proliferation. Western blot assay was used to detect gnome related transcription factor 2 （RUNX2）， collagen type X alpha 1 chain （COL10A1）， transforming growth factor beta receptor 1 （TGFBR1）， SMAD3 and pSMAD3 protein expression. The target of miR-10b was screened in StarBase database， and the targeting relationship between miR-10b and TGFBR1 was verified by dual luciferase reporter gene assay. Results The serum expression of miR-10b was higher in the ISS group than that of the healthy control group， and the higher the miR-10b expression， the more obvious the decrease of child height， IGF-1 and alkaline phosphatase  （P＜0.05）. Compared with the NC group， the cell proliferation ability and RUNX2， COL10A1， TGFBR1， and pSMAD3 protein expression were up-regulated in the miR-10b inhibitor group （P＜0.05）. StarBase database suggested that miR-10b had a binding site of TGFBR1， and dual luciferase reporter gene assay confirmed that TGFBR1 interacted with miR-10b （P＜0.05）. Compared with the si-NC group， the expression of TGFBR1 was down-regulated and the cell proliferation ability was decreased in the si-TGFBR1 group （P＜0.05）. Conclusion miR-10b inhibits chondrocyte proliferation and hypertrophy in idiopathic short stature by targeting TGFBR1/SMAD3 pathway.

Key words： idiopathic short stature; receptor， transforming growth factor-beta type Ⅰ; miR-10b; Smad3 protein

特发性矮小（idiopathic short stature，ISS）是矮小症中最常见的类型，即患者生长激素水平正常，而身高在不伴有潜在病理状态下低于同龄、同性别人群身高平均值2个标准差（SD）［1］。ISS病因不明，占所有身材矮小儿童的60％～80％，严重影响儿童生长发育与生活质量，给心理健康造成极大影响，早发现、早诊断对改善患儿终身高至关重要。近年来，非编码RNA生物标志物研究成为热点。研究表明，血液中微小RNA（microRNA，miRNA）在不同生理、病理状态下具有特定的表达水平和模式，稳定性、重复性较好，有助于疾病的早期诊断［2-3］。转化生长因子β（TGF-β）信号通路在胚胎骨发育和出生后骨稳态中都有重要作用，与早期胚胎发育和器官发生、免疫监督、组织修复密切相关［4］。本课题组前期预试验发现miR-10b在ISS儿童血清中上调表达量最高，本文进一步研究miR-10b与ISS的关系及作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年8月—2021年8月在我院接受治疗的54例ISS患者（ISS组）。纳入标准：（1）身高低于同性别、同年龄、同地区、同种族正常参考值平均数-2 SD。（2）出生时身长和体质量正常，而且身材匀称。（3）无明显的慢性器质性疾病（肝、肾、心、肺、内分泌代谢病和骨骼发育障碍）。（4）无心理和严重的情感障碍，饮食正常。（5）生长速率稍慢或正常，一般每年生长速率＜5 cm。（6）染色体正常。（7）生长激素（GH）激发试验GH峰值≥10 μg/L，且胰岛素样生长因子1（IGF-1）浓度正常。（8）骨龄正常或延迟。排除标准：（1）资料不全者。（2）伴有系统性慢性疾病，如先天性心脏病、哮喘、营养不良等疾病者。ISS组男30例，女24例，年龄5～12岁，平均（8.77±0.35）岁，平均身高（122.3±11.42）cm。选取同期进行体检的健康儿童54例（健康对照组），男29例，女25例，年龄5～12岁，平均（8.69±0.46）岁，平均身高（133.2±10.61）cm，2组性别（χ2=0.037）、年龄（t=1.017）比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。ISS组身高较健康对照组下降（t=37.311，P＜0.01）。本研究经我院伦理委员会审核并批准（2019医研伦审第10号），患儿或家属均知情并签署研究同意书。所有对象于入院后首次检查时采集血液样本，采集后立即在液氮中冷冻，-80 °C的冰箱中保存待用。

1.2 细胞及试剂 人软骨细胞系C28/I2、293T细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清（FBS）和链霉素-青霉素双抗均购自美国Gibco公司。TGF-β受体1（TGFBR1）、重组人SMAD家族成员3（SMAD3）、磷酸化SMAD3（pSMAD3）、X型胶原α1链（COL10A1）、侏儒相关转录因子2（RUNX2）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗IgG二抗均购自英国Abcam公司，红细胞裂解液购自北京索莱宝科技有限公司。BeyoRTTM II cDNA第一链合成试剂盒及ECL发光试剂购自碧云天生物技术有限公司。TaqMan? Universal PCR Master Mix、TaqMan miRNA特异性引物、pmirGLO-TGFBR1萤光素酶载体（野生型或突变型质粒）均购自深圳华大基因有限公司，StepOne Plus实时荧光定量PCR仪购自上海凌仪生物科技有限公司。Lipofectamine 3000 购自Invitrogen公司。miR-10b抑制物（miR-10b inhibitor）、模拟物（miR-10b mimic）及其对照（miR-NC）、TGFBR1小干扰RNA（si-TGFBR1）及其阴性对照（si-NC）均购自广州锐博生物科技有限公司，DAB显色剂购自武汉博士德公司。双萤光素酶报告基因购自美国Promega公司。IGF?1、骨特异性碱性磷酸酶（BAP）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购于英国Immunodiagnostic systems公司。

1.3 方法

1.3.1 人血miR-10b检测 利用3倍体积的红细胞裂解液与血液样本混匀，3 000 r/min离心10 min后移除上清液，可見白色颗粒沉于管底。随后利用Trizol试剂提取总RNA，使用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒将总RNA进行逆转录，使用SYBR Green PCR Master Mix进行实时荧光定量PCR（qPCR），以U6基因作为内参。20 μL反应体系：SYBR? Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55℃ 45 s，72 ℃ 30 s，40个循环。

1.3.2 血清IGF-1和BAP检测 取ISS组空腹静脉血5 mL，5 000 r/min离心10 min后取血清，采用ELISA法检测IGF-1和BAP表达水平，检测步骤按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.3 细胞培养 使用添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基培养人软骨细胞系C28/I2，将细胞置于5%CO2和37 ℃恒温培养箱中培养。利用胰蛋白酶按照1∶2的比例进行细胞传代。

1.3.4 细胞转染 取对数生长期C28/I2细胞，消化后制成单细胞悬液，将2×104个/mL的单细胞悬液接种至6孔板内。待软骨细胞融合度达到30%～40%时，使用Lipofectamine 3000行瞬时转染miR-10b inhibitor、miR-NC、si-TGFBR1及si-NC，分别为miR-10b inhibitor组、NC组、si-TGFBR1组、si-NC组。

1.3.5 qPCR检测基因表达 利用Trizol试剂提取细胞中总RNA，参照1.3.1进行qPCR检测miR-10b表达，以U6基因作为内参。另使用BeyoRTTM II cDNA第一链合成试剂盒逆转得到cDNA，以GAPDH为内参，使用TaqMan? Universal PCR Master Mix进行qPCR，检测TGFBR1、pSMAD3的表达水平。反应体系及反应条件同方法1.3.1，以2-ΔΔct法计算目的基因的表达量，引物序列由华大基因公司合成，见表1。

1.3.6 CCK-8实验检测细胞增殖 4组细胞接种于96孔板（每孔1×103个细胞），加入培养基正常培养，各时间点（0、24、48、72 h）均于37 ℃下加入CCK-8试剂 1 h。在450 nm波长处检测光密度（OD）值。

1.3.7 Western blot检测蛋白表达 采用RIPA试剂提取细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量。蛋白质经10% SDS-PAGE分离，电转移至PVDF膜。用5%脱脂奶粉孵育1 h，TBST洗涤5次后滴加TGFBR1、SMAD3、pSMAD3、RUNX2、COL10A1、GAPDH一抗（均为1∶1 000稀释），于4 ℃孵育过夜。与HRP标记的兔抗IgG（1∶5 000）室温孵育1 h，TBST洗涤5次后用ECL发光试剂检测蛋白条带。以GAPDH为内参，使用Image J软件分析目的蛋白相对表达量。

1.3.8 miR-10b与TGFBR1靶向关系的预测与验证 使用StarBase v2.0数据库（https：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）预测miR-10b与TGFBR1的结合位点；进行双萤光素酶报告基因测定确认TGFBR1和miR-10b之间的结合关系。在12孔板中，1×105个细胞悬液培养至40%，利用Lipofectamine 2000将miR-10b模拟物或NC（50 nmol/L）和1 μg pmirGLO-TGFBR1萤光素酶载体（野生型或突变型质粒）共转染293T细胞。在转染后24 h进行萤光素酶活性检测。细胞分组：TGFBR1 3?-UTR-WT+miR-10b mimic/NC、TGFBR1 3?-UTR-MUT+ miR-10b mimic/NC。

1.4 统计学方法 采用GraphPad Prism 8软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以[x] ±s表示，2组间均数比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-10b在ISS中的表达 qPCR结果表明，ISS组血清miR-10b表达量高于健康对照组（2.68±0.25 vs. 1.12±0.21，t=35.111，P＜0.01）。以miR-10b中位表达量2.54为界，将ISS组分为miR-10b高表达组（≥2.54）和低表达组（＜2.54）各27例。

2.2 ISS组患儿血清miR-10b表达与患儿临床资料的关系 miR-10b高、低表达组患儿体质量和BMI差异均无统计学意义（P＞0.05）；miR-10b低表达组身高、IGF-1、BAP高于高表达组（P＜0.05）。见表2。

2.3 抑制miR-10b表达促进软骨细胞的增殖、肥大 qPCR结果表明，miR-10b inhibitor组miR-10b表达量低于NC组。CCK-8实验结果显示，抑制miR-10b后48、72 h，C28/I2软骨细胞增殖能力较NC组升高（P＜0.05），见表3。Western blot结果显示，抑制miR-10b表达后，RUNX2及COL10A1蛋白表达量上调（P＜0.05），见图1。

2.4 miR-10b调控TGFBR1/SMAD3通路 Western blot结果显示，与NC组相比，抑制miR-10b表达后TGFBR1、pSMAD3表达上调（P＜0.01），见图2。

2.5 miR-10b靶向调控TGFBR1 StarBase数据库分析发现，miR-10b能与TGFBR1 mRNA的3'-UTR结合，见图3A。双萤光素酶报告实验表明，在TGFBR1 WT中，与NC组相比，miR-10b mimic组萤光素酶活性降低（P＜0.05），在TGFBR1 MUT中，2组间差异无统计学意义，见图3B。

2.6 敲低TGFBR1表达可抑制C28/I2细胞增殖 qPCR结果表明，si-TGFBR1组TGFBR1表达量低于si-NC组，TGFBR1低表达模型构建成功。CCK-8结果显示，抑制TGFBR1表达72 h后，C28/I2细胞增殖能力较si-NC组降低（P＜0.05），见表4。

3 讨论

ISS是一种内分泌相关疾病，诊断困难，发病机制不明，其发病原因与遗传、骨骼发育障碍等多因素有关，已成为严重影响儿童身心健康的疾病之一［5］。目前，ISS的主要治疗方法是重组人生长激素，但ISS患者并不表现生长激素缺乏，因此重组人生长激素对ISS患者疗效不一。同时，临床上使用大剂量重组人生长激素还会引起高血糖、高胰岛素血症及骨和软骨瘤等不良反应［6］。因此，进一步阐明ISS的发病机制，探讨ISS生物标志物是当前临床关注的重点，做到早发现、早诊断，以期降低ISS患病率或提高ISS患者的生活质量。

ISS患者的主要临床症状为生长迟缓，具体表现为身高、体质量、骨骼生长、发育异常。骨骼发育主要与骨纵向生长有关，研究表明纵向骨主要与生长板驱动有关，软骨细胞在生长板内经历细胞增殖、分化肥大，进而转化为骨，影响骨的纵向生长［7］。目前，非编码RNA的稳定性、特异性已引起临床广泛关注，在肿瘤、炎症、发育异常等各类疾病中发挥作用［8］。例如，LncRNA MALAT-1通过吸附miR-22促進上皮性卵巢癌的生长和转移［9］，下调miR-21是克服结肠癌、肝癌等癌症耐药的一种有前景的策略［10］。非编码RNA可调控软骨细胞的增殖和凋亡［11-12］，从而可能影响骨的纵向生长。lncRNA对骨代谢平衡有重要调控作用，可通过多种信号通路和转录因子影响间充质干细胞成骨分化过程［13］。miR-143可以调节生长板的损伤［14］。既往研究发现，miR-10b过表达可以抑制乳腺癌［15］、胃癌［16］细胞株的生长。另有研究发现［17］，miR-10b-5p可促进成肌细胞增殖，抑制肌纤维形成，但关于miR-10b对ISS的影响尚未见报道。笔者前期预试验通过对ISS患者和健康人标本进行高通量测序，发现miR-10b在ISS患者血清中高表达，但其具体发病机制尚不清楚。在本研究中，进一步扩大患者样本量，采用RT-qPCR进一步证实了miR-10b在ISS患者组的表达量较健康对照组上调，提示miR-10b可能与ISS的发生和发展密切相关，是一个潜在的诊断生物标志物。IGF?1与营养、骨代谢密切相关，且在青少年时期随年龄增长和身体发育而增高，BAP主要由活跃的成骨细胞释放，其水平升高表示骨代谢增加。本研究中ISS患儿miR-10b表达越高，IGF?1、BAP表达量越低，表明miR-10b与骨代谢、发育有关。骨是体内最具活力的器官，通过骨的形成和吸收不断进行重塑。一系列的分子和途径导致成骨细胞分化，而成骨分化又归因于骨生成或骨形成。RUNX2是一种对成骨细胞分化和软骨细胞成熟至关重要的转录因子［18］。在成骨细胞分化过程中，RUNX2在未定向间充质细胞中弱表达，在前成骨细胞中表达上调，在未成熟成骨细胞中达到最高水平，在成熟成骨细胞中表达下调。近年来发现，许多miRNA可调控RUNX2的表达或活性，从而影响成骨过程。如miR-135和miR-203靶向RUNX2会抑制乳腺癌和转移性骨病的进展［19］。本研究发现，抑制miR-10b表达后，RUNX2与COL10A1表达量较NC组升高，提示敲除miR-10b显著促进了软骨细胞的增殖、肥大。

為探讨miR-10b的潜在作用机制，笔者进一步预测并证明TGFBR1基因是miR-10b的直接靶基因。TGFBR1是TGF-β/SMAD通路的重要组成部分，可以将TGF-β信号从细胞表面转导到细胞质中，这一过程对于软骨细胞的增殖和分化是必不可少的。TGF-β作为一种多功能多肽细胞因子，在早期胚胎发育和成人体内稳态中起着至关重要的作用。SMAD蛋白不仅是信号转导蛋白，而且是介导多种信号通路的转录调节因子，如TGF-β、BMP和Wnt信号通路。TGF-β在与Ⅱ型受体（TGFBR2）结合后，会将TGFBR1募集到高度保守的近膜区域；然后激活的TGFBR1会磷酸化其下游靶标，包括信号转导子SMAD家族成员SMAD2和SMAD3［20］。Xiao等［21］发现TGF-β/SMAD信号通路通过调控miR-455-5p/RUNX2轴抑制icmt诱导的终板软骨细胞退变。本研究发现敲低TGFBR1的表达可抑制软骨细胞的增殖，另外抑制miR-10b表达可上调TGFBR1蛋白及SMAD3的磷酸化水平，表明miR-10b可能通过靶向调控TGFBR1表达抑制SMAD3信号通路，从而调节软骨细胞的增殖、肥大。

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