黄精皂苷与多糖超声辅助提取工艺优化及降血糖活性研究

谢冰宗 李 密 董彩文 王 鑫 刘 菡 马艳莉

(1. 郑州轻工业大学食品与生物工程学院,河南 郑州 450000;2. 南阳理工学院张仲景国医国药学院,河南 南阳 473000;3. 河北农业大学食品科技学院,河北 保定 071000)

黄精(Polygonatumsibiricum)为药食同源性植物,主要分布在北半球温带地区,中国的华北、华中、华南等地均有分布[1]。黄精根茎中富含多种活性成分,如多糖、皂苷、生物碱、三萜、木脂素、类黄酮等[2],具有抗脂肪肝、抗糖尿病、保护肾脏、保护神经、增强免疫力、抗炎、抗癌等作用[3]。目前,市场上只有小部分黄精用于活性物质开发等方面,存在黄精产业发展不平衡、资源利用不充分等问题[4]。

黄精多糖(Polygonatumsibiricumpolysaccharides,PSPs)是黄精中含量最多的活性物质,具有增强免疫力、抗糖尿病和抗菌抗炎等作用,还可调节相关蛋白表达,减少氧化应激,发挥抗衰老作用[5-8]。黄精皂苷(Polygonatumsibiricumsaponins,PSSs)是黄精中另一主要活性物质,主要包括甾体皂苷类和三萜皂苷类化合物,具有抗糖尿病、调节免疫、抑制癌细胞增值和诱导凋亡等作用[9-11]。PSPs和PSSs因具有多种功能活性,且对人体低毒副作用,在食品和医药工业生产等领域应用前景广阔。

目前,关于PSPs或PSSs的提取方法较多。其中,PSPs的水提醇沉法提取率能达到19.87%[12],而新技术的加入(如超高压法和超声辅助酶法)可将其得率提升至25%左右[13-14]。PSSs的提取方法有生物酶法[15]、浸渍法[16]、闪式提取法[17]等,其中生物酶法的得率最高。目前,大部分研究均主要关注单一活性物质的提取,关于协同提取二者以及二者复合后的降糖活性的研究尚未见报道。研究拟通过超声波辅助处理黄精原料的同时进行PSSs的第一步提取,后以剩余残渣作为原料,在超声辅助下利用纤维素酶和木瓜蛋白酶解提取PSPs,并对PSSs进行二次提取,利用两种酶的酶解效果,以期提高二者得率。采用响应面试验优化超声波法协同提取PSSs和PSPs的工艺条件,并通过对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制能力评价PSSs、PSPs及其复合物(PSSs-PSPs)的体外降糖活性,以期为黄精功能成分的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

黄精:一蒸一晒,经鉴定为百合科黄精属植物黄精(Polygonatumsibiricum),河南联源生物科技股份有限公司;

人参皂苷Rb1标准品、香草醛(分析纯)、无水葡萄糖标准品、阿卡波糖、α-淀粉酶(46.6 U/mg):上海源叶生物科技有限公司;

无水乙醇、浓硫酸、苯酚:分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;

纤维素酶:10万 U/g,山东隆科特酶制剂有限公司;

木瓜蛋白酶:10万 U/g,南宁庞博生物工程有限公司;

α-葡萄糖苷酶:50 U/mg,南京都莱生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 PSSs和PSPs联合提取 联合提取工艺见图1。

图1 PSSs和PSPs的协同提取工艺流程[18]

1.2.2 酶的选择 精密称取1 g黄精粉末,加入适量蒸馏水并调节pH,分别加入3 000 U/g的纤维素酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶—木瓜蛋白酶复合物(m纤维素酶∶m木瓜蛋白酶为1∶1),单酶酶解条件参照产品说明书,复合酶解条件参照文献[19-20],取PSPs沉淀定容至100 mL,测定并比较上清液中PSPs得率,确定酶种类。

1.2.3 复合酶比例的选择 根据酶种类筛选结果,固定总加酶量为3 000 U/g,考察m纤维素酶∶m木瓜蛋白酶分别为1∶9,2∶8,3∶7,4∶6,6∶4,7∶3,8∶2,9∶1时,复合酶比例对酶解效果的影响。

1.2.4 联合提取单因素试验

(1) PSSs提取单因素试验:分别考察超声料液比[1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,1∶30 (g/mL)]、超声温度(40,45,50,55,60 ℃)、超声时间(30,35,40,45,50 min)对PSSs得率的影响。

(2) PSPs提取单因素试验:分别考察酶解时间(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 h)、酶解料液比[1∶15,1∶20,1∶25,1∶30,1∶35 (g/mL)]、酶添加量(1 000,2 000,3 000,4 000,5 000 U/g)、热水浸提时间(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 h)、热水浸提温度(75,80,85,90,95 ℃)对粗PSPs得率的影响。

1.2.5 PSSs和PSPs联合提取的响应面优化试验

(1) PSSs提取的响应面优化试验:依据单因素试验,以超声温度、料液比和超声时间为影响因素,以PSSs得率为指标进行三因素三水平响应面优化试验。

(2) PSPs提取的响应面优化试验:依据单因素试验,以酶解时间、酶添加量、酶解料液比为因素,以PSPs得率为指标进行三因素三水平响应面优化试验。

1.2.6 PSSs、PSPs得率测定

(1) PSSs得率:参照中国药典[1]并加以调整。精密移取配制好的人参皂苷Rb1标准溶液(1 mg/mL)各0.03,0.06,0.09,0.12,0.15,0.18,0.21 mL于10 mL试管中,60 ℃水浴挥干溶剂,加入8%香草醛—甲醇溶液0.5 mL和浓硫酸5 mL,60 ℃水浴10 min,冰水浴10 min,测定560 nm处吸光度,绘制标准曲线方程为Y=0.643 8X+0.003 4(R2=0.993 9),并测定稀释后样品PSSs含量在0～0.21 mg范围内的线性关系。按式(1)计算提取液中PSSs得率。

(1)

式中:

Y——提取物得率,%;

C1——根据回归方程计算的样品溶液质量浓度,mg/mL;

V1——提取液体积,mL;

m——样品原料质量,mg。

(2) PSPs得率:精密移取D-无水葡萄糖对照品溶液(0.112 mg/mL) 0,1,2,3,4,5 mL于10 mL容量瓶中,定容。取1 mL溶液,加入6%苯酚1 mL和浓硫酸5 mL,测定490 nm处吸光度,绘制标准曲线(方程为Y=13.899X-0.002 7,R2=0.999),并测定稀释后样品PSPs含量在0～0.056 mg/mL范围内的线性关系。按式(1)计算PSPs得率。

1.2.7 降糖活性测定 分别制备质量浓度为2,4,6,8,10 mg/mL的PSSs、PSPs、PSSs-PSPs(mPSSs∶mPSPs为1∶2)样品溶液,并以6 mg/mL的阿卡波糖为阳性对照溶液进行降糖活性测定。

(1) 对α-葡萄糖苷酶的抑制能力:参照刘勇等[21]的方法稍作改动。将50 μL不同浓度的各样品溶液加入到100 μL含有α-葡萄糖苷酶(3 U/mL)溶液的磷酸盐缓冲液(PBS,pH 5.5)中,37 ℃孵育10 min,加入50 μL的对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(5 mmol/L),37 ℃孵育60 min,加入50 μL Na2CO3(1 mol/L)终止反应,测定405 nm处吸光度。所有操作在96孔板中进行,所有溶液均使用pH为5.5(0.1 mol/L)的PBS配制或稀释。对照组以等量的PBS替换样品添加,空白对照组中无酶无样品,空白样品组为PBS等量替换酶液添加,以阿卡波糖为阳性对照。按式(2)计算α-葡萄糖苷酶抑制率。

(2)

式中:

R——酶抑制率,%;

ΔA1——对照组和空白对照组吸光度之差;

ΔA2——样品组和空白样品组的吸光度之差。

(2) 对α-淀粉酶的抑制能力:参照李云姣等[22]的方法并改动。取0.5 mL样品与0.5 mLα-淀粉酶溶液(6.5 U/mL)于37 ℃下混合孵育10 min,加入0.5 mL可溶性淀粉溶液(1%),37 ℃孵育10 min,加入1 mL DNS试剂混匀,沸水浴10 min,迅速冷水浴5 min,加入10 mL蒸馏水,测定540 nm处吸光值。所有溶液均使用pH为6.9的PBS(0.02 mol/L,含0.006 mol/L NaCl)配制或稀释。对照组以等量的PBS替换样品添加,空白对照组中无酶无样品,空白样品组为PBS等量替换酶液添加,以阿卡波糖为阳性对照。按式(2)计算α-淀粉酶抑制率。

1.2.8 数据处理 采用Design-Expert 13软件进行响应面设计与分析,采用SPSS软件进行数据分析,采用Origin 2021软件作图;所有试验重复3次取平均值,字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 酶种类对PSPs得率的影响

由图2可知,复合酶处理的提取效果优于单一酶处理的,可能与两种酶的协同作用及PSPs在植物细胞内的存在状态有关。纤维素酶主要破坏植物细胞壁,去除植物细胞的保护屏障,而后细胞破裂,内溶物流出;木瓜蛋白酶分解了糖蛋白中的蛋白质,PSPs得到释放,提高了PSPs得率。综上,选择纤维素酶和木瓜蛋白酶构建复合酶提取PSPs。

图2 酶种类对PSPs得率的影响

2.2 复合酶比例对PSPs得率的影响

由图3可知,当m纤维素酶∶m木瓜蛋白酶为3∶7时,PSPs得率最高,说明复合酶中木瓜蛋白酶起主要作用。因此,后续试验中选择m纤维素酶∶m木瓜蛋白酶为3∶7。

图3 复合酶比例对PSPs得率的影响

2.3 PSSs和PSPs协同提取单因素试验

2.3.1 PSSs提取单因素试验 由图4(a)可知,随着超声料液比的增加,PSSs得率先升高后降低,在超声料液比为1∶25 (g/mL)时达到最大值(2.39%),且与超声料液比为1∶20,1∶30 (g/mL)的相比差异显著(P<0.05)。这可能是因为随着超声料液比的增大,物料与溶剂的接触面积不断增大,有利于PSSs的浸出,但由于物料中PSSs含量有限,且存在其他醇溶杂质,导致在乙醇添加量较大时,会有其他醇溶杂质不断溶出,杂质增多,导致PSSs得率下降。故选择超声料液比1∶25 (g/mL)为中心点进行后续研究。

图4 PSSs提取单因素试验结果

由图4(b)可知,随着超声温度的增加,PSSs得率整体呈先上升后下降趋势。当超声温度为50 ℃时,PSSs得率达到最高(2.87%),与超声温度为45 ℃的相比差异显著(P<0.05)。而超声温度为45,55,60 ℃的得率差异不显著(P<0.05),可能是50 ℃之后的高温破坏了PSSs结构,且溶液黏度显著变大,不利于PSSs的提取。因此,后续试验中选择超声温度为50 ℃。

由图4(c)可知,随着超声时间的延长,PSSs得率先上升后下降,在40 min时达到最高(2.62%),与超声时间为30,50 min的相比差异显著(P<0.05),可能是超声时间的增加使黄精粉末与乙醇溶液接触更充分,促进了PSSs的溶出,但处理时间过长,分子量较大、不稳定的PSSs易发生分解,且伴随其他醇溶物质的溶出,从而降低了PSSs得率。因此,选择超声时间40 min进行后续试验。

2.3.2 PSPs提取单因素试验 由图5(a)可知,随着酶解时间的延长,PSPs得率先上升后下降,在酶解时间为2 h时达最大值21.56%。当酶解时间>2 h时,PSPs得率下降,与2 h时相比具有显著性差异(P<0.05)。这可能是酶解时间过长,酶催化活性减弱,同时PSPs也发生了部分水解[23]。因此,选用2 h作为后续酶解时间。

图5 PSPs提取单因素试验结果

由图5(b)可知,PSPs得率随酶解料液比的增加先上升后下降,当酶解料液比为1∶25 (g/mL)时,PSPs得率最高为20.9%,与酶解料液比为1∶15,1∶20 (g/mL)的相比差异显著(P<0.05);而后随着酶解料液比的增加,PSPs得率又明显降低,与1∶25 (g/mL)的相比差异显著(P<0.05)。这可能是随着溶剂的增加,酶与底物的接触面积也逐渐增加,能更好地促进酶与底物反应,但酶解料液比太大时会带来能量损失,降低酶解效果,溶液浓度过低也会减弱超声波对物料的机械作用[24]。因此,选择酶解料液比为1∶25 (g/mL)进行后续试验。

由图5(c)可知,随着酶添加量从1 000 U/g增加到3 000 U/g,PSPs得率显著增加,当酶添加量为3 000 U/g时,PSPs得率为18.61%,进一步增加酶添加量至4 000,5 000 U/g时,与酶添加量为3 000 U/g时的相比差异不显著(P>0.05),说明此时复合酶已达到饱和状态。因此,结合实际生产中的成本控制因素,选择酶添加量3 000 U/g进行后续试验。

由图5(d)可知,随着热水浸提时间从0.5 h增加至1.0 h,PSPs得率显著提高,达到20.85%,进一步延长热水浸提时间,PSPs得率变化不大,且与1.0 h的相比差异不显著(P>0.05),但继续延长热水浸提时间至2.5 h时,得率又明显下降。这可能是浸提时间过短,PSPs溶解不充分[25],随着浸提时间的增加,经酶解释放的PSPs逐步溶解,浸提时间过长时,部分PSPs结构被破坏,得率降低。因此,结合实际生产效率,选择1.0 h作为最佳热水浸提时间。

由图5(e)可知,随着热水浸提温度从75 ℃升高到80 ℃,PSPs得率达21.17%,而后随着热水浸提温度的升高,PSPs得率变化不大,且二者之间差异不显著(P>0.05);继续升高热水浸提温度至95 ℃时,PSPs得率显著减小。这可能是随着热水浸提温度的升高,PSPs的溶解量逐渐升高,当酶解释放的PSPs完全溶解时,在一定浸提温度范围内得率变化不大,而后过高的浸提温度会破坏PSPs的结构,导致得率降低。因此,选择80 ℃作为最佳浸提温度。

2.4 响应面优化试验

2.4.1 PSSs提取的响应面试验 基于单因素试验结果,选取超声温度、超声料液比、超声时间为自变量,以PSSs得率为响应值优化PSSs的最佳提取工艺条件。PSSs响应面试验因素水平见表1,试验设计及结果见表2。

表1 PSSs提取响应面试验因素与水平

表2 PSSs提取响应面试验设计与结果

通过Design-Expert 13软件分析得到回归模型方程为:

Y=3.04+0.016 9A+0.057 1B-0.006 3C-0.048 2AB-0.009 7AC+0.003 4BC-0.256 9A2-0.485 7B2-0.397 2C2。

(3)

经模型分析,PSSs的最佳提取工艺条件为超声温度50.14 ℃,超声料液比1∶25.289 (g/mL),超声时间,49.921 min此条件下PSSs得率为3.04%。根据实际应用,将最佳工艺条件修正为超声温度50 ℃,超声料液比1∶25 (g/mL),超声时间50 min,测得PSSs平均得率为(3.16±0.12)%(n=3),与理论值相对误差为3.95%,说明该模型有效可靠,工艺可行。

2.4.2 PSPs提取的响应面试验 基于单因素试验结果,选取酶解时间、酶添加量、酶解料液比3个因素为自变量,以PSPs得率为响应值优化PSPs提取工艺。PSPs响应面试验因素水平见表4,试验设计及结果见表5。

表4 PSPs提取响应面试验因素水平表

表5 PSPs提取响应面试验设计与结果

通过Design-Expert 13软件分析得到回归模型方程为:

Y=26.64+0.628 6A+0.541 5B-0.257 1C-0.115 8AB+0.781 0AC+0.561 0BC-4.89A2-2.27B2-0.796 4C2。

(4)

表6 PSPs提取响应面试验方差分析†

图6 各因素交互作用对PSSs得率影响的响应面图

图7 各因素交互作用对PSPs得率影响的响应面图

通过模型分析,PSPs提取的最佳工艺条件为酶解时间2.01 4 h,酶添加量3 053.262 U/g,酶解料液比1∶24.515 (g/mL),此条件下PSPs得率为26.7%。将理论条件修正为酶解时间2 h,酶添加量3 053 U/g,酶解料液比1∶25 (g/mL),测定PSPs得率为(27.07±0.31)%(n=3),与理论值相对误差为1.39%,说明回归模型有效可靠,具有实际应用价值。试验测得的PSPs得率高于传统热水浸提法[14]、水提醇沉法[13]的,也高于苑璐等[19,26]利用酶法提取的。

同时,测得此提取液中PSSs平均得率为9.05%。因此二步提取法得到的PSSs总得率为12.22%,优于包瑞敏等[27-31]采用超声提取法和酶解法的。

2.5 体外α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制活性

由图8可知,随着样品质量浓度的增加,PSSs、PSPs及PSSs-PSPs对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制率均增加。与单一物质相比,PSSs-PSPs对α-葡萄糖苷酶的抑制效果更好,其对α-淀粉酶的抑制效果较差,可能是因为PSSs和PSPs在α-葡萄糖苷酶上的结合位点不同,复合后,二者对酶的抑制作用互不影响或影响不大;但在α-淀粉酶的抑制作用中,PSSs和PSPs二者可能存在结合位点冲突,从而降低了对α-淀粉酶的抑制作用。

图8 PSSs、PSPs及PSSs-PSPs对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率

3 结论

研究以黄精中黄精皂苷和黄精多糖得率为指标,对其提取工艺进行了优化。结果表明,黄精皂苷和黄精多糖的最佳协同提取工艺条件为超声温度50 ℃,超声料液比1∶25 (g/mL),超声时间50 min,酶解时间2 h,酶添加量3 053 U/g,酶解料液比1∶25 (g/mL),m纤维素酶∶m木瓜蛋白酶3∶7,热水浸提时间1 h,热水浸提温度80 ℃。黄精皂苷的两步提取总得率可达12.22%,黄精多糖得率可达27.07%。且黄精皂苷—黄精多糖复合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用强于黄精皂苷和黄精多糖单一组分的,说明二者复合仍具有较好的降糖活性,可作为开发具有降血糖功能食品的原料。后续可研究黄精皂苷、黄精多糖以及黄精皂苷—黄精多糖复合物对酶的抑制类型、纯化程度及其复合比例对降糖活性的影响。