延边黄牛肉干、湿法成熟过程中嫩度的变化

张博媛 孙德鹏 王钰涵 田敬怡 牟柏德 崔明勋 李官浩

(1. 农业农村部延边特色高品质牛肉精深加工创新重点实验室,吉林 延吉 133002;2. 东北寒区肉牛科技创新教育部工程研究中心,吉林 延吉 133002;3. 延边大学农学院,吉林 延吉 133002)

在评价鲜肉食用质量特征时,嫩度在消费者接受程度上起着至关重要的作用[1]。动物经屠宰后肌细胞处于无氧状态导致肌肉收缩,影响肉的嫩度。在成熟过程中由于内源性蛋白水解酶调控细胞凋亡[2],加快肌原纤维蛋白和结缔组织蛋白的水解,以蛋白质降解为主的生化反应能够改善肉的质地。目前常见的宰后成熟方式有干法成熟和湿法成熟两种[3-4],均能显著提高肉的嫩度[5]。Kim等[6]分别将牛肉进行了28 d的湿法成熟和干法成熟,发现干熟样品的剪切力低于湿熟样品;也有研究[7]表明,干法成熟至14～35 d时,牛肉的嫩度和剪切力虽然持续改善,但14 d之后的嫩度改善效果显著降低。张睿[8]的研究结果也显示了干法成熟和湿法成熟均有效改善牦牛西冷的嫩度,且成熟时间越长,改善效果越好。肌纤维已被确定为影响肉类品质的重要因素,肉的最终嫩度也取决于肌原纤维结构的改变和降解的程度[9-10]。因此,为了探究宰后不同成熟过程中肉嫩度的变化,有必要深入探究成熟过程中肌原纤维蛋白降解与结构特性改变对宰后牛肉的影响。

延边黄牛臀肉中脂肪含量低,肌纤维比例较高,推断其在成熟过程中结构改变和降解速率较快[11]。研究拟以臀肉作为材料,分别进行30 d的干法成熟和湿法成熟,通过比较肉的嫩度相关品质、肌纤维结构特性和蛋白质降解程度,分析宰后成熟过程中嫩度变化,以优化最佳的嫩化方式为实际加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雄性成年延边黄牛:龙井长白山犇福清真肉业有限公司;

氯化钾、氯化镁、乙二胺四乙酸、甲醛、乙醇、二甲苯、尿素、硫脲:分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;

BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、考马斯亮兰染色套装、苏木素伊红(HE)染色试剂盒:北京索莱宝科技有限公司;

pH计:pH-STAR型,北京天翔飞域科技有限公司;

高速分散均质机:DY89-Ⅱ型,宁波新芝生物科技股份有限公司;

质构仪:TMS-PLUS型,北京盈盛恒泰科技有限责任公司;

酶标仪:Multiskan FC型,德国赛默飞世尔科技公司;

组织切片机:HistoCore BIOCUT型,德国徕卡公司。

1.2 成熟工艺

成年雄性延边黄牛屠宰后,将臀肉均匀分割成形状统一、重量为(2.0±0.2) kg的肉块,充分混合后随机分为2组进行30 d的干法成熟和湿法成熟,干法成熟(D):悬挂在发酵箱中,温度2～4 ℃,相对湿度(RH)(85±5)%,风速1.2 m/s;湿法成熟(W):真空包装放置于2～4 ℃的环境中;每组6块,同时取2块作为0 d空白对照样品,各处理组分别在成熟10,20,30 d时取样。

1.3 试验方法

1.3.1 剪切力值测定 将温度计插入肉块中心,于蒸煮袋内水浴加热至温度为75 ℃后取出,充分冷却后顺肌纤维方向切成1 cm×1 cm×3 cm的长条测定剪切力值,测试速度60 mm/min,初始力0.5 N。

1.3.2 水分含量测定 参照GB 5009.3—2016。

1.3.3 pH 采用pH计法。

1.3.4 肌原纤维小片化指数的测定 参考张诗泉等[12]的方法并修改,取2 g成熟牛肉样品,加入30 mL缓冲液(100 mmol/L KCl,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L MgCl2,pH 7.0),冰浴匀浆1 min。在4 ℃、10 000 r/min离心15 min,弃去上清液,在沉淀中再次加入20 mL缓冲液,充分溶解后用BCA试剂盒测定蛋白浓度后,稀释至质量浓度为0.5 mg/mL,于540 nm下测溶液的吸光度,将吸光度值乘200后,即为肌原纤维小片化指数。

1.3.5 石蜡切片制备及染色 肉样垂直肌纤维方向切成1 cm×1 cm×0.5 cm的小块后放置于体积分数4%的甲醛溶液中固定24 h,再用自来水冲洗过夜。将组织切成合适大小装入包埋盒,依次于体积分数为70%,80%,90%,95%,100%的酒精中脱水1 h,再放置于二甲苯中浸泡10 min透明;分别于软蜡和硬蜡中浸泡1 h后包埋。用石蜡切片机将组织切成6 μm的薄片后HE染色。

1.3.6 肌纤维结构观察 用显微镜观察染色后的切片并拍照,随机选取20根肌纤维[13],用Image-pro plus软件计算肌纤维横截面积S和肌纤维直径L;肌纤维密度D以单位面积S1内肌纤维数量N计算。

1.3.7 蛋白提取 根据Roberto等[14]的方法。取1 g肉样,加入10 mL 50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)后,在冰浴中匀浆2 min,4 ℃ 10 000×g离心20 min,取上清液,为肌浆蛋白提取物;再次向沉淀中加入等体积缓冲液,涡旋后离心除掉上清液中的可溶性蛋白,再向沉淀中加入10 mL含6 mol/L尿素和1 mol/L硫脲的50 mmol/L Tris-HCl涡旋5 min,4 ℃ 10 000×g离心20 min,将上清液置于活化后的透析袋中4 ℃透析过夜,即得肌原纤维蛋白提取液。

1.3.8 SDS-PAGE分析 用BCA蛋白定量试剂盒测量提取的肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的浓度,并用磷酸盐缓冲液调至2 mg/mL。以体积比3∶1加入4×蛋白上样缓冲液,在沸水中煮5 min至变性。SDS-PAGE条件:分离胶质量分数12%,浓缩胶质量分数5%,上样量10 μL,先以80 V电压电泳直到条带于浓缩胶与分离胶临界处,然后以140 V电压电泳直到指示条带至分离胶底端,用考马斯亮蓝套装染色、脱色后观察。

1.4 数据统计与分析

每个试验平行重复3次,结果以“平均值±标准差”表示;采用SPSS 27.0.1软件中单因素方差分析数据是否具有显著性差异,P<0.05表示差异显著。

2 结果与讨论

2.1 剪切力值的变化

由图1可知,两种成熟方式的剪切力值均随时间延长呈显著下降趋势(P<0.05),这一过程是由蛋白酶的作用或钙离子在成熟过程中引起肌原纤维间Z线降解引起的[15]。相比于干法成熟,湿法成熟对嫩度有更好的改善作用(P<0.05),是由于无氧状态下宰后肌肉发生糖酵解等生化反应使pH值下降[16],变性的肌原纤维蛋白成为组织蛋白酶B、蛋白酶体6等蛋白酶系统更容易作用的靶点,在牛肉嫩化方面也很重要[17-18]。

小写字母表示同种成熟方式不同成熟时期差异显著(P<0.05);大写字母表示相同时期不同成熟方式间差异显著(P<0.05)

2.2 水分含量的变化

由图2可知,干法成熟过程中牛肉水分含量随成熟时间延长呈下降趋势,且显著低于湿法成熟组(P<0.05)。湿法成熟的水分含量稳定归因于真空包装,而干法成熟由于环境湿度的影响,在牛肉解僵和成熟过程中汁液流失过多,水分含量降低。肌肉中的水分含量一定程度上会影响肉的嫩度,牛肉脱水使肌纤维空隙增大[19],因此干法成熟牛肉的嫩度低于湿法成熟样品。

小写字母表示同种成熟方式不同成熟时期差异显著(P<0.05);大写字母表示相同时期不同成熟方式间差异显著(P<0.05)

2.3 pH值的变化

pH值对宰后牛肉的嫩度和持水力等都有一定的影响[20]。由图3可知,干法成熟牛肉的pH值随时间延长呈上升趋势,湿法成熟的相反。这可能是由于微生物的作用,干法成熟牛肉表面的低水分环境有利于酵母菌的增殖[21],蛋白质分解产生胺类等碱性物质使得成熟期间pH值升高。而湿法成熟样品由于真空包装隔绝氧气,乳酸菌增殖导致成熟期间pH值降低[22]。有研究表明,在湿法成熟过程中,pH值下降增强了caspase-3的激活和线粒体功能障碍诱导的细胞凋亡[23],或由于低pH值改变了质子的稳态,降低了肌原纤维蛋白之间的静电斥力,引起肌肉纤维不可逆侧向收缩,使牛肉嫩度提升[24]。

小写字母表示同种成熟方式不同成熟时期差异显著(P<0.05);大写字母表示相同时期不同成熟方式间差异显著(P<0.05)

2.4 肌原纤维小片化指数变化

由图4可知,两种成熟方式的肌原纤维小片化指数均随时间延长呈上升趋势,且湿法成熟显著高于干法成熟组(P<0.05),分别达到339.8±16.6和231.6±19.0。肌原纤维小片化指数在一定程度上能够间接预测肉的嫩度,变化趋势反映出牛肉结构蛋白水解程度随成熟时间的延长而升高,并被降解为片段[25]。肌纤维间I带断裂、肌联蛋白降解等变化降低肌原纤维结构强度,使肉的嫩度提高[12]。

2.5 肌纤维特性变化

延边黄牛肉干法成熟和湿法成熟过程中肌纤维结构特性如图5和表1所示。干法成熟组肌纤维特性随时间延长均无显著差异(P>0.05),湿法成熟组肌纤维面积和直径均随时间延长呈降低的趋势,肌纤维密度显著升高(P<0.05)。湿法成熟组的肌内膜边缘降解,逐渐模糊、厚度变小,肌纤维之间排列紧密,几乎没有间隙,这可能是导致湿法成熟样品嫩度提升的原因之一。推测肌内膜和肌束膜等结缔组织的变化对肉的嫩度一样起着关键作用[26]。宰后成熟是改善肉品质的重要途径,控制细胞凋亡能够调控肉品嫩化的进程,或通过调节蛋白酶活性及产生作用的持续时间来控制[27]。

表1 延边黄牛肉宰后成熟过程中肌纤维组织学特性†

2.6 肌浆蛋白和肌原纤维蛋白SDS-PAGE分析

如图6可知,两种成熟方式在成熟30 d时,Ⅰ肌浆(180 kDa蛋白条带)处出现新的条带,可能是大分子肌浆蛋白降解的结果;肌浆蛋白是水溶性蛋白,包括糖酵解途径的许多酶[28],其中肌酸激酶和醛缩酶(35～48 kDa范围内两条蛋白条带)随成熟时间延长逐渐降解;干法成熟组Ⅱ肌浆(25 kDa蛋白条带)和Ⅲ肌浆(11 kDa以下蛋白条带)明显深于湿法成熟。以上条带的变化说明干法成熟更容易使牛肉中相对分子质量高的肌浆蛋白分解成为相对分子质量低的蛋白,且种类增多,浓度增大。

图6 延边黄牛肉宰后成熟过程中肌浆蛋白的降解

如图7可知,肌球蛋白和肌动蛋白变化不明显,但随着成熟时间的延长,原肌球蛋白(35～45 kDa处蛋白条带)和肌钙蛋白(17 kDa蛋白条带)出现,肌球蛋白轻链(25 kDa蛋白条带)逐渐加深,由以上蛋白条带变化可知,肌原纤维蛋白的降解主要发生在17～48 kDa范围内,湿法成熟样品由于内源酶作用蛋白水解更强烈[18],出现的新条带可能是肌动蛋白和肌球蛋白的降解产物[29],肌原纤维是肌肉结构蛋白,牛肉成熟过程中肌原纤维蛋白降解和肌原纤维小片化指数增加显示出肌原纤维结构被破坏。

图7 延边黄牛肉宰后成熟过程中肌原纤维蛋白的降解

3 结论

干法成熟和湿法成熟均能够提升延边黄牛肉的嫩度,剪切力值、肌原纤维小片化指数以及蛋白降解等嫩度相关指标随时间延长存在显著变化(P<0.05)。由于湿法成熟组牛肉蛋白降解快,肌原纤维破裂指数显著高于干法成熟组,并且从肌纤维结构可以观察到湿法成熟组肌纤维内膜边缘降解,肌纤维排列紧密,肉质更嫩(P<0.05)。干法成熟组在11～25 kDa范围内的肌浆蛋白条带明显加深,说明延边黄牛肉在成熟过程中肌浆蛋白降解为相对分子质量小的蛋白,改善肉的嫩度。研究宰后成熟过程中蛋白质降解、肌纤维结构变化对牛肉嫩度的影响有利于延边黄牛肉高档产品的加工贮藏,在后续的试验中应更加深入研究湿法成熟过程中内源性蛋白酶如半胱氨酸蛋白酶和钙蛋白酶等对肌肉细胞凋亡、结缔组织降解的影响。