两种酸笋主要成分、挥发性成分及抗氧化活性对比

廖 安 杜海平 程 昊,2 刘天义 田 艳,2,

(1. 广西科技大学,广西 柳州 545006;2. 广西柳州螺蛳粉工程技术研究中心,广西 柳州 545006;3. 宁乡市市场和质量监督检验检测中心,湖南 宁乡 410600;4. 广西金竹山食品科技有限责任公司,广西 柳州 545006;5. 柳州市添翼种养专业合作社,广西 柳州 545008)

酸笋是经发酵制成的特色食品,富含有机酸、膳食纤维、微量元素等[1-2],而且糖类和脂肪含量低,广受两广地区的消费者喜爱。广西的酸笋原料为麻竹笋,广东的酸笋原料通常为毛竹笋。不同种类的竹笋、种植海拔高度以及在不同区域种植的竹笋的营养成分、食用价值、安全品质都有较大差别。

竹笋被传统医学视为治疗许多疾病的药物[3-5],且具有抗氧化、抗癌、抗衰老、抗自由基、减肥、预防心血管疾病、促进消化等功效[6-8]。随着竹笋生物活性功能的发现,一些研究者开始了发酵竹笋的功能研究。如冯翠萍等[9]研究发现,含酸笋皮的饲料能显著提高小鼠高密度脂蛋白胆固醇含量,显著下降小鼠低密度脂蛋白胆固醇含量,说明酸笋皮有降血脂的功效。然而,对于酸笋的抗氧化活性、广东粤北和广西柳州地区酸笋成分含量的对比分析还未见报道。

研究拟对广西和广东地区酸笋中的各项成分进行比较,并采用体外抗氧化活性方法(ABTS自由基、DPPH自由基清除方法和FRAP法)对二者提取物的抗氧化活性进行测定,以期为酸笋的腌制工艺和工业生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

GDYBNX酸笋、GXLZTY酸笋:市售;

无水对氨基苯磺酸、N-(1-萘基)乙二胺盐酸盐:分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;

十水合四硼酸钠:分析纯,佛山西陇化工有限公司;

邻苯二甲酸氢钾、氯化钠:标准品,天津市科密欧化学试剂有限公司;

乙酸、二水合乙酸锌、氢氧化钠、硝酸、铬酸钾、亚硝酸钠、三水合六氰铁(II)酸钾、甲基红、过氧化氢:分析纯,四川西陇科学有限公司;

酚酞:分析纯,天津市大茂化学试剂厂;

无水乙醇、盐酸:分析纯,成都市科隆化学品有限公司;

硝酸银:分析纯,天津市赢达稀贵化学试剂厂;

芦丁:优级纯,上海齐一生物科技有限公司;

没食子酸:标准品,上海纯优生物科技有限公司;

2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、抗坏血酸(VC):优级纯,北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计:UV-1601型,北京瑞利分析仪器有限公司;

电热鼓风干燥箱:101-1AB型,天津市泰斯特仪器有限公司;

pH计:PHS-3C型,上海仪电科学仪器股份有限公司;

电子天平:BL-220H型,日本岛津有限公司;

电子天平:ME204E型,梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司;

离心机:VCK-22R型,湖南迈克尔实验仪器有限公司;

冷冻干燥仪:Alpha 1-2 LDplus型,德国Christ公司;

超声波清洗机:KM-500DV型,昆山美美超声仪器有限公司;

电感耦合等离子体质谱仪:7850型,安捷伦科技有限公司;

赛默飞电感耦合等离子发射光谱仪:ICAP 7200 HS Duo型,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;

GC-MS联用仪:7000D型,安捷伦科技有限公司;

弹性石英毛细管柱(60 m×250 μm×0.25 μm):TG-5 SILMS型,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;

固相微萃取装置:SPME-GC型,美国Supelco公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酸笋提取物制备 GXLZTY酸笋和GDYBNX酸笋,晾干,真空冷冻干燥后粉碎,分别与体积分数70%的乙醇溶液以1∶25 (g/mL)的比例混合,在70 ℃恒温水浴中提取30 min,然后在4 000 ×g离心10 min。收集上清液,用旋转蒸发器浓缩至一定体积,真空冻干得到待测样品。

1.3.2 主要成分测定

(1) 水分:按GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中的直接干燥法执行。重复检测3次,结果取平均值。

(2) 氯化物:按GB 5009.44—2016《食品安全国家标准 食品中氯化物的测定》中的直接滴定法执行。重复检测3次,结果取平均值。

(3) pH:酸笋试样用研钵研磨粉碎,按m酸笋∶V水为1∶1 (g/mL)加水混合成匀浆后,使用精密pH计进行测定。重复检测3次,结果取平均值。

(4) 总酸:按GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》中的酸碱指示剂滴定法执行。重复检测3次,结果取平均值。

(5) 可溶性总糖:根据NY/T 1278—2007《蔬菜及其制品中可溶性糖的测定 铜还原碘量法》执行。重复检测3次,结果取平均值。

(6) 脂肪:按GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》中的索氏抽提法执行。重复检测3次,结果取平均值。

(7) 蛋白质:根据GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法执行。重复检测3次,结果取平均值。

(8) 氨基态氮:根据GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基态氮的测定》中的酸度计法执行。重复检测3次,结果取平均值。

(9) 膳食纤维:按GB 5009.88—2016《食品安全国家标准 食品中膳食纤维的测定》执行。

(10) 亚硝酸盐:按GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的盐酸萘乙二胺法执行。

(11) 总黄酮:参照文献[10]。

(12) 总多酚:参照文献[11]。

(13) 矿物质:按GB 5009.268—2016《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》执行。

(14) 二氧化硫(SO2):按GB 5009.34—2022《食品安全国家标准 食品中二氧化硫的测定》的酸碱滴定法执行。

1.3.3 挥发性成分测定 参照文献[12-13]。

(1) 样品前处理和萃取:在15 mL顶空样品瓶中加入1.2 g NaCl、磁力转子和3 g已捣碎的酸笋并加入相同体积的超纯水混匀,在磁力搅拌转速为300 r/min的50 ℃水浴中加热30 min,然后在50 ℃下使用老化后的萃取头65 μm PDMS/DVB(聚二甲硅氧烷/二乙烯基苯,中极性)萃取30 min。气相色谱柱进样口作为萃取头的老化装置,老化时间及温度按照设备的推荐条件进行(萃取头于250 ℃老化0.5 h),采用氮气吹扫来维持环境惰性,保持样品更纯净。萃取完成后以手动方式进样,在250 ℃下解吸5 min,通过GC-MS测定结果。

(2) GC条件:进样器温度250 ℃,色谱柱为TG-5 SILMS(60 m×250 μm×0.25 μm)型,柱箱升温程序:在40 ℃下停留5 min,以8 ℃/min上升至80 ℃,保持0 min,以1 ℃/min上升至90 ℃,保持0 min,以5 ℃/min上升到160 ℃,保持1 min,以20 ℃/min上升至250 ℃,保持15 min。

(3) MS条件:传输线温度230 ℃,离子能级70 eV,采用正常扫描模式,扫描质荷比范围为45～500。

1.3.4 抗氧化活性测定

(1) ABTS自由基清除能力:参照文献[14]修改如下:将5 mL的ABTS溶液(7.4 mmol/L)和88 μL的过氧化二硫酸钾(2.6 mmol/L)混合,反应12 h得到ABTS自由基溶液。0.1 mL不同质量浓度(50,100,150,200,200,300,400,500,500,600 μg/μL酸笋提取物)的样品溶液中分别加入ABTS自由基溶液(5 mL),在黑暗中反应6 min。在734 nm处测定吸光度(用A1表示),重复3次。空白组用去离子水代替作为空白对照(用A0表示),以VC为阳性对照组。按式(1)计算ABTS自由基清除率。

(1)

式中:

R1——自由基清除率,%;

A1——空白对照吸光度;

A0——阳性对照吸光度。

(2) DPPH自由基清除能力:参照文献[14]修改如下:0.1 mmol/L DPPH溶液用无水乙醇制备,2 mL DPPH溶液与2 mL不同质量浓度(50,100,150,200,300,400,500,500,600 μg/μL酸笋提取物)的样品溶液混合,在室温黑暗中反应30 min。在520 nm处测定吸光度(A1表示),重复3次,空白组用去离子水代替作为空白对照(A0表示),以VC为阳性对照组。按式(1)计算DPPH自由基清除率。

(3) 铁(III)离子还原能力(FRAP):参照文献[14]修改如下:将醋酸缓冲液(0.03 mol/L),pH 3.6)、TPTZ(0.01 mol/L)和铁(III)六水合物(0.02 mol/L)以10∶1∶1的体积比混合均匀,得到反应混合物。取0.1 mL 不同质量浓度(0,50,100,100,150,200,300,400,500,600 μg/μL酸笋提取物)的样品中分别加入2.4 mL的反应混合物。以VC为阳性对照组,在593 nm处测定吸光度,重复3次。以硫酸亚铁的浓度为横坐标,相应的吸光度为纵坐标,绘制铁(II)FRAP活性(mg硫酸亚铁当量/g)标准曲线,根据标准曲线计算样品的铁(II)FRAP活性(mg硫酸亚铁当量/g)。

1.4 数据处理

采用 Excel 2010 制作图表,试验数据采用Origin 2018软件进行统计学处理。挥发性成分对照质谱库NIST 11 Library进行物质分析定性,采用积分法计算绝对峰面积,并通过峰面积归一化法计算各组分相对含量。

2 结果与分析

2.1 不同地区酸笋及其提取物主要成分分析

2.1.1 酸笋主要成分 由表1可知,GXLZTY酸笋和GDYBNX酸笋中水分、pH、可溶性总糖、脂肪、氨基酸态氮和亚硝酸盐的含量无较大差异,而氯化物、总酸、蛋白质、膳食纤维、总黄酮、总多酚以及所有的矿物质元素的含量有显著性差异,除总酸、蛋白质、膳食纤维以及元素Cr、W外,GXLZTY酸笋中氯化物、总黄酮、总多酚以及矿物质元素Na、Ca、K、Mg、P、S、Fe、Cu、Zn、Ni、Mn、Sn、Al、Ba、Ti、TI、Sr、Rb、Li、Mo、Sc、Si、B、Zr的含量显著高于GDYBNX酸笋(P<0.05)。据报道[15],鲜竹笋含蛋白质3.28 g/100 g,碳水化合物4.47 g/100 g,纤维素0.90 g/100 g,脂肪0.13 g/100 g,钙22.0 mg/100 g,磷56.0 mg/100 g,铁0.1 mg/100 g,而表1中酸笋的蛋白质、钙、铁含量都远高于文献[15]报道的。黄酮是一种很强的抗氧化剂,其含量的增加可提高酸笋的抗氧化能力。许志美等[16]发现,自然发酵2～8 d的芦笋的总黄酮含量为3.668 mg/100 g,较试验中的两种酸笋的高。不同地区、不同品种的酸笋主要成分上的差异,可能受到竹笋原料地理位置、土壤条件、气候环境及加工方式等因素的影响。

表1 酸笋的主要成分含量(湿基)†

2.1.2 酸笋提取物主要成分 由表2可知,GXLZTY酸笋和GDYBNX酸笋提取物中可溶性总糖和脂肪的含量无较大差异,而二氧化硫、总黄酮和总多酚的含量有显著性差异,且GXLZTY酸笋的含量显著高于GDYBNX酸笋(P<0.05)。与表1中结果相反,GDYBNX酸笋提取物中蛋白质和氨基酸态氮的含量显著高于GXLZTY酸笋提取物(P<0.05),这种情况可能是由于:① 蛋白质的亲和性差异。麻竹笋和毛竹笋的蛋白质可能具有不同的亲和性,即在提取过程中与不同化学物质相互作用的能力。麻竹笋中的蛋白质可能更容易被提取剂捕获。② 蛋白质的结构差异。麻竹笋和毛竹笋的蛋白质可能在结构上存在差异,这可能导致它们在提取和分析过程中的行为不同。例如,某些蛋白质可能具有更紧密的结构,更难以在提取过程中解离出来,因此在提取物中的含量较低。

表2 酸笋提取物主要成分含量(干基)†

2.2 不同地区酸笋挥发性成分分析

采用GC-MS技术对广东GDYBNX和GXLZTY酸笋中挥发性成分进行鉴定,两种酸笋挥发性成分GC-MS分析的总离子流色谱图见图1、图2。对照谱库,GDYBNX酸笋挥发性成分分析如表3所示,GXLZTY酸笋挥发性成分分析如表4所示。GXLZTY酸笋中共鉴定出5种主要的挥发性成分,包括对甲基苯酚相对含量为95.19%,己酸相对含量为1.14%,辛酸相对含量为0.47%,2-乙基己醇相对含量为0.14%,二氧化硫相对含量为0.08%。GDYBNX酸笋中共鉴定出3种主要的挥发性成分,包括对甲基苯酚相对含量为99.5%,醋酸相对含量为0.35%,丝氨醇相对含量为0.18%。

图1 GXLZTY酸笋挥发性成分的总离子流色谱图

图2 GDYBNX酸笋挥发性成分的总离子流色谱图

表3 GXLZTY酸笋主要挥发性成分

表4 GDYBNX酸笋酸笋主要挥发性成分

GDYBNX酸笋中对甲基苯酚的相对含量较高,达到99.5%,可能是其具有鲜明香气的原因。同时,含有0.35%的醋酸使其具有一定的酸味。相较之下,GXLZTY酸笋中对甲基苯酚相对含量为95.19%,己酸和辛酸分别占1.14%和0.47%,可能是其具有独特风味的原因。对甲基苯酚是一种挥发性有机化合物,对酸笋的风味和品质具有重要作用。对甲基苯酚的气味具有一定的刺激性,能为酸笋带来独特的香气,使其具有辨识度和吸引力。而且对甲基苯酚具有一定的抗氧化性和抗菌作用,有助于保持酸笋的品质稳定,延长保质期。同时,对甲基苯酚的阈值比较低,只有55 μg/kg,对最终风味有决定性影响,与田玉峰等[17]的研究结果一致。其他风味物质如醋酸、己酸、辛酸等与对甲基苯酚共同作用,形成酸笋独特的风味组合。

GDYBNX酸笋中含有0.18%的丝氨醇,使其口感较为柔和。而GXLZTY酸笋中含有0.14%的2-乙基己醇,使其具有一定的涩味。GXLZTY酸笋中含有0.08%的二氧化硫,其在一定程度上具有抗氧化和防腐作用,能延长酸笋的保质期。而GDYBNX酸笋中未检出二氧化硫。虽然挥发性成分的差异对酸笋的营养价值影响不大,但不同的挥发性成分可能会影响消费者对酸笋的喜好程度。例如,对甲基苯酚含量较高的GDYBNX酸笋可能更受喜欢浓郁香气的消费者的青睐,而含有己酸和辛酸的GXLZTY酸笋可能更适合喜欢独特风味的消费者。

2.3 不同地区酸笋的抗氧化活性

由图3(a)可知,随着酸笋提取物质量浓度的增加,两种提取物对ABTS自由基的清除活性逐渐增加。在提取物质量浓度<300 μg/μL时,GXLZTY酸笋提取物对ABTS自由基的清除活性为75%,显著高于GDYBNX酸笋提取物(P<0.05)。提取物质量浓度为300～600 μg/μL时,两种提取物的活性均无明显变化。综上,GXLZTY酸笋提取物对自由基的清除能力更高。

由图3(b)可知,随着酸笋提取物质量浓度的增加,两种提取物对DPPH自由基的清除能力逐渐增强,当提取物质量浓度为400 μg/mL时,两种提取物均表现出最大的清除能力。在此浓度下,GXLZTY酸笋提取物清除了37%的 DPPH自由基,而GDYBNX酸笋提取物清除了32%的 DPPH自由基,再次表明GXLZTY酸笋提取物的活性高于GDYBNX酸笋提取物(P<0.05)。

由图3(c)可知,两种提取物的抗氧化活性均随其质量浓度的增加而增加,在400 μg/μL质量浓度下,GXLZTY酸笋和GDYBNX酸笋的FRAP活性分别为146,122 mg FeSO4/g。与清除ABTS自由基和DPPH自由基一样,GXLZTY酸笋提取物的抗氧化活性略高(P<0.05)。因此,GXLZTY酸笋提取物具有更高的抗氧化和自由基清除活性。

有研究[18-21]表明,黄酮、多酚、对甲基苯酚和二氧化硫能够通过中和及清除自由基,阻止自由基引起的氧化反应。GXLZTY酸笋中黄酮、多酚、对甲基苯酚和SO2的含量均显著高于GDYBNX酸笋的,因此推测GXLZTY酸笋有更高的抗氧化能力与以上成分有关。

3 结论

GXLZTY酸笋相比GDYBNX酸笋含有更高的氯化物、总黄酮、总多酚和矿物质元素(Na、Ca、K、Mg、P、S、Fe、Cu、Zn、Ni、Mn、Sn、Al、Ba、Ti、TI、Sr、Rb、Li、Mo、Sc、Si、B、Zr),而GDYBNX酸笋在总酸、蛋白质、膳食纤维和元素Cr、W方面稍高。GXLZTY酸笋中主要挥发性成分为对甲基苯酚,而GDYBNX酸笋中主要挥发性成分为对甲基苯酚和醋酸。不同地区来源的酸笋在主要营养成分上存在差异,可能受到竹笋原料地理位置、土壤条件、气候环境和发酵加工方式等因素的影响。此外,GXLZTY酸笋提取物表现出更高的抗氧化活性和自由基清除能力,对ABTS自由基和DPPH自由基的清除能力以及FRAP活性均高于GDYBNX酸笋提取物。后续将对GXLZTY酸笋和GDYBNX酸笋中的黄酮、多酚和对甲基苯酚含量进行更详细的测定,以确定它们与抗氧化活性的确切关系。此外,还需要进一步探讨影响这些化合物含量的因素,以便更好地利用这些具有抗氧化活性的自然资源。