鸽源鼠伤寒沙门氏菌的分离鉴定及耐药与毒力基因检测

陆 凡,王 鹏,刘林敏,黄振兴,张明霞,杜文珍,吴颖臻,韦 平,韦天超,2*

(1.广西大学动物科学技术学院,广西南宁 530004;2.广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心,广西南宁 530004)

沙门氏菌(Salmonella)是属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的革兰氏阴性、相对厌氧、无芽孢的短杆菌[1]。沙门氏菌一直被认为是人类和动物的重要食源性病原体[2]。采用标准Kauffman-White法已经确定了2 600多个血清型的沙门氏菌,这些血清型中的绝大多数能够适应包括人类在内的各种动物宿主[3-4]。鸽沙门氏菌病又称鸽副伤寒,主要由鼠伤寒沙门氏菌引起,能够导致鸽出现败血症、下痢、关节炎、运动神经障碍等症状[5-6]。鼠伤寒沙门氏菌具有广泛的致病性,既能水平传播也能垂直传播,并通过感染的动物或者动物产品威胁公共卫生安全[7]。沙门氏菌的致病力取决于多种毒力因子,这些毒力因子的调控表达帮助病原菌黏附、定殖、侵入细胞从而感染宿主致病[8]。研究表明,这些毒力因子与分布在毒力岛、质粒、鞭毛和菌毛等毒力基因有关[9],所以明确沙门氏菌携带的毒力基因对判断其毒力至关重要。沙门氏菌等食源性病原体的耐药性是影响公共卫生安全的一个重要问题,而由于抗菌药物的不规范使用及滥用、质粒介导的耐药基因水平传递,促进了耐药细菌的传播和发展[10-11],从而更难以防治。养鸽业的不断发展也扩大了沙门氏菌的传播途径,威胁公共卫生安全。因此,对养鸽场沙门氏菌流行情况及其生物学特性的掌握已十分必要。

本试验从广西南宁某鸽场送检的两批疑似患鸽副伤寒的濒死的20日龄鸽的肝脏组织中进行细菌的分离鉴定,对分离菌株进行耐药性和毒力基因检测,为该病的临床防控及致病机制的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 广西南宁某鸽场于2021年3月和2022年1月分两批送检的20日龄濒死鸽若干只。

1.1.2 主要试剂和培养基 普通营养琼脂平板自行配制;麦康凯培养基、木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂、MH琼脂,北京陆桥技术股份有限公司产品;沙门氏菌生化鉴定盒,广东环凯微生物科技有限公司产品;沙门氏菌诊断血清,宁波天润生物技术有限公司产品;药敏试纸,杭州天和微生物试剂有限公司产品;大肠埃希氏菌标准株ATCC 25922,由广西壮族自治区疾病预防控制中心赠予;2×EsTaqMasterMix(Dye),广西南宁康维生物科技有限公司产品;DNA标准,宝日医生物技术(北京)有限公司产品。

1.1.3 仪器设备 PCR仪,美国ABI公司产品;凝胶成像仪,美国Analytik Jena US LLC公司产品;电泳仪,北京六一生物科技有限公司产品;恒温培养箱,上海实验仪器总厂产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养 用接种环无菌采集病鸽肝脏病料接种于普通营养琼脂平板,于37 ℃培养24 h,将可疑菌落接种于麦康凯培养基于37 ℃培养24 h,挑取无色单菌落划线接种于XLD琼脂于37 ℃培养24 h后观察菌落形态。将普通营养琼脂平板获得的单个菌落纯培养物进行革兰氏染色和镜检。

1.2.2 生化鉴定 根据沙门氏菌生化鉴定盒使用说明,在无菌条件下将分离菌株纯培养的单菌落分别接种细菌生化鉴定管,于37 ℃培养24 h后进行结果观察。

1.2.3 血清型鉴定 按说明书要求,将分离菌株纯培养单个菌落与诊断血清做凝集试验。根据沙门氏菌属抗原诊断表,判定分离菌株的血清型。

1.2.4 16S rRNA扩增 使用16S rRNA通用引物(表1)进行PCR扩增[12]。将纯化后的PCR产物送北京六合华大基因科技有限公司测序。测序结果在NCBI数据库中以Blast程序进行同源性比对,选取相似性较高的菌株和沙门氏菌不同血清型参考株的16S rRNA序列,用软件MEGA 7.0中Neighbor-Joining方法构建系统发育树。

表1 16S rRNA通用引物序列Table 1 16S rRNA universal primer sequences

1.2.5 药敏试验及耐药基因检测

1.2.5.1 药敏试验 药敏试验采用Kirby-Bauer(K-B)纸片扩散法测定分离菌株对17种抗菌药物的敏感性,同时以大肠埃希氏菌标准株ATCC 25922作为质控菌。

1.2.5.2 耐药基因检测 参考文献合成细菌常见的6类19种耐药基因特异性引物(表2),引物均由南宁捷尼斯生物科技有限公司合成[13-14]。扩增体系25 μL:DNA模板2.5 μL,上、下游引物各1 μL,2×EsTaqMasterMix(Dye) 12.5 μL,ddH2O 8 μL。PCR扩增程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,退火 30 s,72 ℃ 30 s,共35个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表2 耐药基因引物信息Table 2 Primer information of drug resistance genes

1.2.6 毒力基因检测 根据文献发表的沙门氏菌invA、sseL、mogA、mgtC、sopB、spvA、spvB、spvC、spvD、spvR、stn、fimA等毒力基因序列,设计合成12对引物[13,15]。引物均由南宁捷尼斯生物科技有限公司合成(表3)。PCR扩增体系及反应条件同上。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表3 毒力基因引物信息Table 3 Primer information of virulence genes

2 结果

2.1 临床症状和病理变化

病鸽主要表现为精神萎靡、消化不良、腹部发黑、拉黄白痢、消瘦脱水脚干(图1A)。剖检结果显示,病鸽腹腔积液,肝脏淤血肿大、发黑,心脏肿大,脾脏肿大、充血,肺脏严重肿大、出血,肠道有条状出血(图1B)。

A.腹部发黑;B.肝脏淤血肿大A.Black abdomen;B.Liver congestion and swelling图1 病鸽的临床症状和病理剖检结果Fig.1 Clinical symptoms and pathological lesions of diseased pigeon

2.2 细菌分离培养及形态观察

试验分离到2株沙门氏菌疑似菌株,分离菌株在普通琼脂培养基的菌落形态为圆形、湿润光滑、白色半透明(图2A),在麦康凯平板的菌落形态为圆形、湿润光滑、无色透明(图2B),在XLD琼脂培养基的菌落形态为有光泽带黑色中心、湿润光滑(图2C)。经革兰氏染色,油镜下可见分离菌株为无荚膜和芽孢的革兰氏阴性短杆菌(图2D)。

A.营养琼脂培养基;B.麦康凯培养基;C.XLD培养基;D.革兰氏染色镜检(1 000×)A.Nutrient agar medium;B.MacConkey agar medium;C.XLD medium;D.Gram staining microscopy (1 000×)图2 菌落形态及革兰氏染色结果Fig.2 Colony morphology and Gram staining results

2.3 细菌生化鉴定

由表4可知,两株分离菌株能发酵甘露醇、葡萄糖和麦芽糖,不发酵乳糖和蔗糖,吲哚试验、尿素酶及V-P试验阴性,柠檬酸盐试验及赖氨酸脱羧酶试验阳性,符合沙门氏菌生化特性。

表4 分离菌的生化鉴定结果Table 4 The results of biochemical identification of isolated strains

2.4 血清型鉴定结果

2株分离菌株与沙门氏菌A～F多价O血清发生凝集反应,与对照生理盐水不发生凝集反应,且与沙门氏菌单因子血清O1、O4、O5、O12及Hi、H1、H2发生凝集反应,根据沙门氏菌属抗原诊断表,判定2株分离菌株血清型为1,4,5,12:i:1,2,初步鉴定2株分离菌株为鼠伤寒沙门氏菌。

2.5 16S rRNA PCR扩增及系统发育树构建

如图3所示,2株分离菌株16SrRNA基因PCR扩增出1 500 bp目的条带。将测序得到的序列在NCBI数据库以Blast程序进行同源性比对并在软件Mega 7.0中构建系统发育树。结果显示,2株分离株与沙门氏菌参考株MW282039.1、CP053865.1、CP050739.1在同一分支(图4),与鼠伤寒沙门氏菌同源性大于99.5%。综合以上分离菌株的生化鉴定、血清型鉴定和16S rRNA测序分析的结果,确定两株分离菌株均为鼠伤寒沙门氏菌,分别命名为Typhi-Mar25-NN2021和Typhi-Jan30-NN2022。

M.DNA标准DL 2 000;1～2.疑似沙门氏菌样本DNAM.DNA Marker DL 2 000;1-2.Sample DNA of suspected Salmonella图3 16S rRNA基因扩增结果Fig.3 PCR amplificationresults of 16S rRNA gene

图4 分离菌株与参考菌株16S rRNA基因系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of isolated strains and representative Salmonella enterica strains based on the sequence of 16S rRNA gene

2.6 药敏试验结果

采用17种抗菌药物药敏片进行药敏试验,结果显示,2株分离菌株均对萘啶酸、链霉素和四环素耐药,对头孢类、硝基呋喃类和氯霉素类敏感。两株菌对青霉素类抗生素和磺胺类的磺胺异恶唑的敏感性存在一定差异。值得注意的是,2株分离菌株均表现多重耐药。药敏试验结果见表5。

表5 药敏试验结果Table 5 Results of antimicrobial susceptibility test

2.7 耐药基因检测结果

由图5可知,6类19种耐药基因PCR检测结果表明,Typhi-Mar25-NN2021株携带sul2、aadA1、strB、qnrA、tetA和tetC耐药基因,对磺胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类和四环素类药物具有耐药性。Typhi-Jan30-NN2022株携带blaCMY-2、blaTEM-1、aadA1、strB、qnrA和tetC耐药基因,对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类和四环素类药物具有耐药性。

M.DNA标准 DL 2 000;P1.Typhi-Mar25-NN2021;P2.Typhi-Jan30-NN2022;A～H.分别代表sul2、aadA1、strB、qnrA、tetA、tetC、blaCMY-2和blaTEM-1基因M.DNA Marker DL 2 000;P1.Typhi-Mar25-NN2021;P2.Typhi-Jan30-NN2022;A-H.sul2,aadA1,strB,qnrA,tetA,tetC,blaCMY-2 and blaTEM-1 genes,respectively图5 耐药基因扩增结果Fig.5 Amplification results of drug resistance genes

2.8 毒力基因检测结果

由图6可知,2株分离菌株分别扩增出与毒力岛基因invA(395 bp)、sseL(527 bp)、mogA(419 bp)、mgtC(231 bp)、sopB(782 bp);毒力质粒基因spvA(432 bp)、spvB(590 bp)、spvC(513 bp)、spvD(316 bp)、spvR(491 bp);肠毒素基因stn(341 bp);菌毛基因fimA(321 bp)大小一致的目的片段。Typhi-Mar25-NN2021株和Typhi-Jan30-NN2022株对invA等12种毒力基因检测均为阳性。

M.DNA 标准 DL 1 000;A.Typhi-Mar25-NN2021;B.Typhi-Jan30-NN2022;1～12.分别代表invA、sseL、mogA、mgtC、sopB、spvA、spvB、spvC、spvD、spvR、stn和fimA基因M.DNA MarkerDL 1 000;A.Typhi-Mar25-NN2021;B.Typhi-Jan30-NN2022;1-12.invA,sseL,mogA,mgtC,sopB,spvA,spvB,spvC,spvD,spvR,stn and fimA genes,respectively图6 毒力基因扩增结果Fig.6 Amplification results of virulence genes

3 讨论

沙门氏菌是导致急性腹泻和食源性疾病暴发的主要细菌病原体之一,鼠伤寒沙门氏菌是引起沙门氏菌病的常见血清型[16]。鼠伤寒沙门氏菌是感染人类和动物的主要肠道病原体,其感染始于食入污染的食物或水,使沙门氏菌到达肠道上皮并引发胃肠道疾病[17]。有研究表明,12月龄鸽肉高蛋白、低脂肪的特点能更好满足消费者对营养的需求[18]。为了满足不断增加的肉鸽需求,肉鸽场的养殖规模也不断扩大,部分养鸽场环境卫生和饲养管理水平没有提高,细菌性疾病就容易发生。方光远等[19]报道了从多个肉鸽养殖场中分离到鸽沙门氏菌。此外,Abdeen E等[20]在野生鸽中分离到沙门氏菌多重耐药菌株。可见,鸽感染沙门氏菌已非常普遍,而且,鸽沙门氏菌病主要由鼠伤寒沙门氏菌引起。目前在鸽的养殖生产中,抗菌药物作为防治鸽沙门氏菌病的首选且被广泛使用。然而.抗菌药物的频繁使用会导致动物体内微生物群或病原体群体的适应,这种干预措施的长期后果,包括影响原籍菌群的微生态平衡、病原体的进化以及规避干预措施的病原体突变体的出现[21]。

本试验在两批送检病鸽的肝脏组织中分离出病原菌并通过对分离菌株的生化、血清型鉴定和16S rRNA序列分析等,鉴定出2株鼠伤寒沙门氏菌,与我国华东[22]、华南[23]地区分离出的鸽沙门氏菌血清型一致,这说明鼠伤寒沙门氏菌为鸽沙门氏菌病病原菌常见血清型。本试验选取常用的17种抗菌药物进行药敏试验,结果表明,2株分离菌均对萘啶酸、链霉素和四环素耐药,对头孢类、硝基呋喃类和氯霉素类抗菌药物具有较高的敏感性,对青霉素类抗生素和磺胺类的磺胺异恶唑的敏感性存在一定差异,耐药基因检测结果表明Typhi-Mar25-NN2021株携带磺胺类(sul2)、氨基糖苷类(aadA1、strB)、喹诺酮类(qnrA)、四环素类(tetA、tetC)耐药基因,Typhi-Jan30-NN2022株携带β-内酰胺类(blaCMY-2、blaTEM-1)、氨基糖苷类(aadA1、strB)、喹诺酮类(qnrA)和四环素类(tetC)耐药基因,耐药表型与耐药基因型相符。试验结果与吕敏娜等[24]、谢冠东等[25]报告的研究结果相近。在张启龙等[12]的报道中,信鸽源鼠伤寒沙门氏菌对氯霉素类的氟苯尼考表现耐药,这说明在不同地区、不同养殖场的沙门氏菌的耐药性存在较大差异。值得注意的是,本试验分离的2株鼠伤寒沙门氏菌均表现多重耐药,主要可能与饲养管理中抗菌药物的频繁使用,使用种类较多有关。在应用抗菌药物更好防控鸽沙门氏菌感染的同时,也要高度重视不科学不规范的使用带来的多重耐药问题。因此在养殖生产中必须以药敏试验结果为依据科学用药,才能提高治疗效果,有效控制疫情蔓延,避免耐药性细菌的传播和发展。

多重耐药沙门氏菌除了因耐药导致抗菌药物失效所带来的危害,菌株本身的毒力也是其危害之一。沙门氏菌通过侵入、附着和绕过宿主的胃酸等肠道防御机制在宿主体内定殖,许多毒力标志物和决定因素已被证明在其致病机制中起着重要作用,这些因素包括毒力岛、毒力质粒、菌毛等,致病力强弱与其毒力基因表达密切相关[26]。本试验分离到的两株鼠伤寒沙门氏菌均携带毒力岛invA、sseL、mogA、mgtC、sopB基因、毒力质粒spvA、spvB、spvC、spvD、spvR基因、肠毒素stn基因、菌毛fimA基因,说明分离菌株具有强毒力的潜在威胁。有研究表明,沙门氏菌对昆明小鼠的致病力与毒力岛sseL基因密切相关[27],本试验分离菌株均携带sseL基因,这也佐证了2株鼠伤寒沙门氏菌分离株具有强致病性。由于试验条件限制,本试验仅对毒力基因进行了鉴定,2株分离菌株的毒力差异仍有待进一步研究。毒力质粒具有传播性,而分离菌株对检测的5种毒力质粒基因均呈阳性,这也提示该鸽场要特别注意在养殖环节防控鼠伤寒沙门氏菌的感染,加强饲养管理,隔离病鸽、对症治疗,及时阻断该病的传播。在目前集约化养殖情况下,要建立起完善的生物安全体系,做到管理带动预防。此外,保持鸽场的卫生、设备和饲料的清洁,做好检疫净化和药物净化对鸽沙门氏菌病的防治具有重要意义。

综上所述,本试验从广西某鸽场送检的病鸽肝脏组织中分离鉴定了2株鼠伤寒沙门氏菌。2株鼠伤寒沙门氏菌均对萘啶酸、链霉素和四环素耐药,对青霉素类抗生素及磺胺类的磺胺异恶唑的敏感性存在一定差异,但均呈多重耐药表型,与耐药基因型相符;对invA等12种毒力基因检测呈阳性,提示2株菌株具有强毒力特性。