肉鸡圆圈病毒3型和A型多杀性巴氏杆菌混合感染的检测与分析

庄丽云,雷天宇,戴婷婷,吴玲玲,朱金玲,廖悦辰,牛 群,包银莉,3,黄翠琴,3,戴爱玲,3,郑新添,3*

(1.福建农林大学动物科学学院,福建福州 350000;2.龙岩学院预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室,福建龙岩 364000;3.龙岩学院动物源性人兽共患病防控福建省高校工程研究中心,福建龙岩 364012 )

多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)是一种革兰氏阴性细菌,可以引起包括禽霍乱、牛出血性败血症和猪萎缩性鼻炎[1-2]等疾病,也可引起人的感染。鸡圆圈病毒(Gyrovirus,GyV)是细环病毒科(Anelloviridae)环病毒属(Gyrovirus)的一种单链环状DNA病毒,其与同属的鸡传染性贫血病毒 (Chicken infectious anemia virus,CIAV)均为免疫抑制病毒,鸡圆圈病毒3型(Gyrovirus 3,GyV3)是引发鸡病毒性传染性腺胃炎的主要病原[3-4]。2022年8月,福建省龙岩市某鸡场饲养的58日龄肉鸡出现发育不良、呼吸困难等症状,死亡频次由每天死亡5～10只上升至20～30只;对病鸡进行剖检、实验室诊断和病原学鉴定,确诊其为多杀性巴氏杆菌和鸡圆圈病毒3型的混合感染病例。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 龙岩市某养鸡场送检4只肉鸡,编号为1～4号,对每只病鸡进行剖检并分别无菌采集肝脏、脾脏、肺脏、气管,腺胃及呼吸道黏膜和肠黏膜。

1.1.2 主要试剂 基因组提取试剂盒FastPure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit、PCR Mix,诺唯赞生物科技股份有限公司产品;pMD19-T、DNA标准DL 2 000,宝日医生物技术(北京)有限公司产品;革兰氏染色试剂盒,索莱宝科技有限公司产品;微量生化反应管、药敏试纸,杭州滨和微生物试剂有限公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 PCR仪、台式高速冷冻离心机、生物安全柜,赛默飞世尔科技公司产品;电泳仪,北京六一生物科技有限公司产品;恒温培养振荡器,苏州捷美电子有限公司产品;光学显微镜,麦克奥迪实业集团有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 参照文献[5]设计扩增细菌16SrDNA基因片段的通用检测引物16S-F/R;参照文献[6]设计多杀性巴氏杆菌荚膜基因扩增引物;参照文献[7]设计扩增GyV3VP2基因片段的特异性检测引物,引物信息见表1;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.2 细菌分离与鉴定 取肝脏划线于绵羊血琼脂培养基,37 ℃恒温箱中培养18 h,后进行2次纯化,挑取形态典型的菌落进行革兰氏染色镜检。挑取典型菌落到5%血清肉汤培养基中,37 ℃、200 r/min培养18 h,取纯培养物进行生化反应鉴定,具体操作步骤按照《伯杰氏细菌鉴定手册》第8版方法进行,按说明进行判定。以菌液为模板进行PCR扩增,扩增体系为2×PCR Mix 10 μL,引物16s-f/r 各1μL,模板1 μL,ddH2O补充至20 μL。扩增程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃ 40 s,56℃ 30 s,72℃ 45 s,共35个循环;72℃再延伸5 min。将电泳鉴定后的PCR产物切胶进行产物纯化,然后连接至pMD19-T载体并转化到DH5α感受态细胞,在氨苄西林LB培养基上培养15 h。挑取单菌落扩大培养,经PCR鉴定阳性的转化子菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序,将测序获得的序列利用BLAST程序进行序列对比。

1.2.3 菌株荚膜分型 挑取单菌落在100 μL ddH2O 中,100 ℃加热10 min煮沸,离心取上清作为模板。参照《禽霍乱(禽巴氏杆菌病)诊断技术》(NY/T 563-2016)[6],巴氏杆菌荚膜分型检测方法进行PCR检测(引物序列见表1)。

1.2.4 药敏试验 将纯化菌液均匀涂布于鲜血琼脂培养基上,在无菌条件下使用Kirby-Bauer( K-B)纸片琼脂扩散法测定病鸡分离菌对常见抗菌药物的耐药性[8]。

1.2.5 GyV3 PCR检测 分别处理每只鸡病料,将肝脏与腺胃研磨并反复冻融3次,9 000 r/m离心10 min,取200 μL上清液,使用FastPure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit试剂盒提取基因组。以提取的DNA为模板,分别配置25 μL PCR反应体系:2× PCR mix 12.5 μL,引物(GyV3-VP2-F/R)各0.5 μL,模板1 μL,ddH2O 10.5 μL。PCR扩增程序为:95℃ 3 min;95℃ 15 s;58℃ 15 s;72℃ 15 s;共35个循环;72℃ 5 min。取5 μL PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.6VP2基因克隆及序列测定 将电泳鉴定后的PCR产物切胶进行产物纯化,然后连接至pMD19-T载体并转化到DH5α感受态细胞,在氨苄西林LB培养基上培养15 h。挑取单菌落扩大培养,随后使用M13通用测序引物进行PCR鉴定阳性菌落。将鉴定为阳性的转化子菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.7 GyV3VP2基因遗传进化分析 将所得序列在NCBI网站进行Blast搜索比对,分析所得序列与GenBank已公布序列的同源性,选取典型GyV3VP2基因序列见表2,使用 MEGA 11.0软件构建系统发育树。

表2 GyV3参考毒株相关信息Table 2 GyV3 reference strain-related information

2 结果

2.1 病鸡剖检结果

剖检可见2号病鸡喉头及气管有出血点(图1A),腹腔有纤维素性渗出,肝脏表面有针尖大小灰白色坏死点(图1B),脾脏肿大且有灰白色坏死点,腺胃有溃疡灶(图1C),回盲瓣有明显出血点。

A.气管出血且有黄色黏液;B．肝脏表面有坏死点;C．腺胃有溃疡灶A.Tracheal bleeding with yellow mucus; B.Necrotic spots on the surface of the liver; C.Ulcer foci in the proventriculus图1 剖检结果Fig.1 Autopsy results

2.2 细菌分离培养与生化鉴定

2号鸡肝脏细菌纯化后细菌在鲜血琼脂培养基呈现圆形、微突起、表面光滑、奶油状的菌落(图2A)。取单菌落进行革兰氏染色,镜检可见革兰氏阴性短杆菌,细菌呈椭圆形,两端颜色较深,中心颜色较浅(图2B);生化鉴定结果见表3,初步判断该细菌为多杀性巴氏杆菌。

A.血平板分离培养的单菌落;B.革兰染色(1 000×)A.Single colony isolated and cultured on blood plate;B.Gram staining(1 000×)图2 细菌形态Fig.2 Morphology of bacteria

表3 分离菌株生化鉴定结果Table 3 Biochemical identification results of the isolated strains

2.3 分离株16S rDNA鉴定

用16S rDNA引物对菌液进行扩增,PCR扩增产物电泳结果见图3。扩增的16S rDNA片段大小为1 500 bp左右(图3),将该片段进行克隆测序,获得1 500 bp序列,将其与GenBank中已有序列进行Blast比对,与巴氏杆菌属16S rDNA的相似度达99.9%以上。

M.DNA标准DL 2 000;1.阳性对照;2.样品;3.阴性对照M.DNA Marker DL 2000; 1.Positive control; 2.Sample 3.Negative control图3 分离菌16S rDNA的PCR扩增结果Fig.3 PCR amplification result of bacterial 16S rDNA

2.4 菌株荚膜分型

使用PCR对分离的巴氏杆菌进行分型,PCR扩增产物电泳结果见图4。结果显示,只有荚膜A型引物可扩增出1 000 bp左右的条带,符合预期的1 044 bp片段大小,并且其他分型均未扩出任何条带,进一步判断分离细菌为A型多杀性巴氏杆菌。

M.DNA标准DL 2 000;1～5.分别对应A、B、D、E、F多杀性巴氏杆菌荚膜分型引物PCR扩增结果M.DNA Marker DL 2000;1-5.Corresponding to A,B,D,E and F Pasteurella multocida capsular typing primer PCR amplification results图4 分离菌荚膜血清型的PCR鉴定结果Fig.4 PCR identification results of serotypes of isolated bacteria

2.5 药敏试验

菌株仅对氨苄西林、头孢唑林、头孢拉定、万古霉素、头孢曲松有耐药性,对哌拉西林、头孢氨苄、头孢他啶、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、氧氟沙星、多黏菌素B均表现为高度敏感,对羧苄西林表现为中度敏感(表4)。

表4 药敏试验结果Table 4 Results of drug sensitivity test of isolated bacteria

2.6 GyV3 PCR检测

用GyV3特异性引物进行PCR扩增,2号鸡凝胶电泳结果显示在720 bp左右出现条带(图5),与预期片段大小相符。

M.DNA标准DL 2 000;1.阳性对照;2.样品;3.阴性对照M.DNA Marker DL 2 000;1.Positive control; 2.Sample;3.Negative control图5 GyV3 VP2扩增结果Fig.5 PCR amplification result of GyV3 VP2

2.7 GyV3 VP2基因遗传进化分析

目的片段测序获得序列720 bp,与GenBank 进行Blast比对,显示与GenBank GyV3VP2基因序列相似度达99.9%以上,命名为LY-GyV3-202201。将测序后VP2基因与16株参考株进行核苷酸比较,利用MEGA 11软件构建进化树,通过进化树分析,LY-GyV3-202201株与长春猫源参考株(登录号MK089248)关系最近,结果见图6。

●LY-GyV3-202201为本试验分离株●LY-GyV3-202201 is the isolate of this test图6 基于VP2基因的系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree based on VP2 gene

3 讨论

近年来,鸡传染性病毒性腺胃炎(Transmissible virus proventriculitis,TVP)发病率呈上升趋势,造成了鸡场严重损失。TVP的病原较为复杂[9],也给诊断和防控带来困难。根据临床症状和大体剖检判断,该病鸡表现出典型的TVP症状,为明确病原,对病鸡进行了鸡圆圈病毒、J亚型禽白血病毒、鸡传染性贫血病毒、马立克病病毒、腺胃坏死病毒、呼肠孤病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、网状内皮组织增生病毒检测,结果显示,病鸡中仅检测出GyV3,其他均为阴性;此外,还从病例中检测出多杀性巴氏杆菌,由此,该病例诊断为GyV3和A型多杀性巴氏杆菌共感染。选择较为敏感的庆大霉素进行治疗后,鸡群死亡率下降,新增病例减少,该鸡场病情得到了有效控制,进一步证实该病例中多杀性巴氏杆菌是其主要病原之一,然而由于条件限制,未能进一步对GyV3进行回归试验。GyV3感染并且导致TVP相关报道较少,本研究通过临床剖检、实验室诊断以及遗传进化分析,为GyV3的理论研究和流行病学调查提供了数据参考。

通过遗传进化分析,本次分离株与猫源参考株亲缘关系更近,文献表明在家猫粪便中也曾检测出其他环状病毒[10-11],由于鸡肉是家猫食物的主要来源,这些不同的猫源性环状病毒可能起源于携带环状病毒的鸡肉产品。研究表明GyV3是一种造成再生障碍性贫血、免疫抑制和多系统严重损伤的跨物种致病病毒[12],GyV3作为一种免疫抑制性病毒可以侵害家禽的免疫系统,导致机体更容易出现其他病原的并发或继发感染,并且GyV3是近年来在鸡群发现的新病毒,尚无特异性疫苗预防。多杀性巴氏杆菌是一种常见的共生或机会性病原体,可在大多数家禽、家畜和野生动物的上呼吸道中发现,包括鸡[13]、牛[14]和野生水禽[15]等。龙岩市8月份天气炎热多雨,高温高湿环境给细菌滋生提供良好条件,早晚温差较大致使机体抵抗力下降,最终导致病毒与细菌并发感染。本试验分离的巴氏杆菌为荚膜A型,该血清型与禽霍乱相关菌株的疾病倾向高度相关[16],且近年来在福建地区较为流行[17]。由于巴氏杆菌血清型分类较多,各血清型之间缺乏交叉保护力,因此使用疫苗防控较为困难,临床上推荐使用抗菌药物来防控。本试验结果显示,分离菌对哌拉西林、头孢氨苄、庆大霉素等8种药物表现敏感,推荐使用卡那霉素、庆大霉素等抗革兰氏阴性菌药物,做到轮换用药、缩短用药周期,防止细菌产生耐药性。鸡场应加强饲养管理,及时用药,尤其在高温或天气多变时节改善舍内环境,降低密度,增强鸡群免疫力。

传染性腺胃炎是鸡群常见疾病之一,其病原学和致病机制尚未清楚,本研究对发病鸡进行病原学检测和鉴定,证实发病鸡存在鸡圆圈病毒3型和A型多杀性巴氏杆菌感染,为传染性腺胃炎的病原学及防控研究提供了试验依据。