基于VP6蛋白的牛轮状病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

刘广阔,邹 敏,吴发兴,于皓同,王凯茸,张锐铮,张 琪*,许信刚*

(1.西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌 712100;2.青岛易邦生物工程有限公司/科技部动物基因工程疫苗国家重点实验室,山东青岛 266114;3.中国动物卫生与流行病学中心/国家动物血清库,山东青岛 266114)

牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus)的成员[1]。由牛轮状病毒引发的腹泻,临床上常见于感染1月龄以内的犊牛,因此又被称为犊牛腹泻病毒。腹泻犊牛由于下痢、呕吐而严重脱水,甚至有些犊牛因电解质紊乱而死亡。近年来,我国畜牧业发展迅速,牛轮状病毒感染导致了犊牛生长性能下降,死亡率增高,增大了养殖户的治疗成本及养殖成本[2]。研究表明,对我国多地区牛场的腹泻粪便样品进行检测发现,牛轮状病毒的检出率为20%～58.3%不等[3],由此可见牛轮状病毒是导致牛腹泻的重要病原,给我国养牛业的发展造成了巨大的影响。目前,对于牛轮状病毒感染的常见诊断方法主要有病毒分离、RT-PCR、real-time-PCR、ELISA[4]等。一般牛场缺乏相关设备,往往不能实现前3种诊断,而具备操作简单特点且其灵敏度及特异性也有保障的ELISA法更适合在一般牛场使用[5]。本研究对牛轮状病毒相对保守且抗原性良好的VP6基因进行克隆[6],构建原核表达载体,对表达的VP6蛋白进行变性、纯化、复性并测定其蛋白浓度后作为包被抗原,建立检测牛轮状病毒VP6蛋白抗体的间接ELISA方法,为牛场的牛轮状病毒病的诊断提供一种可供选择的技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料、菌株与质粒 牛轮状病毒阳性病料,由西北农林科技大学动物医学院兽医微生物实验室鉴定并保存;Pet-28a(+)、DH5α感受态细胞、BL21(DE3)细胞,天根生物科技有限公司产品。

1.1.2 血清样品 牛轮状病毒阳性血清、牛冠状病毒阳性血清、牛病毒性腹泻阳性血清、牛呼吸道合胞体病毒阳性血清,均为中国动物卫生与流行病学中心国家动物血清库鉴定并保存;用于临床检测的405份牛血清样品,采集自云南、山西、内蒙部分地区牛场。

1.1.3 主要试剂 DNA/RNA提取试剂盒,西安天隆科技有限公司产品;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒快速小提试剂盒、T4 DNA连接酶,北京天根生物科技有限公司产品;HiScript®Ⅱ One Step RT-PCR Kit,南京诺唯赞生物科技有限公司产品;NcoⅠ和XhoⅠ内切酶,NEB公司产品;TMB显色液,北京索莱宝科技有限公司产品;Ni-NTA His Bind Resin镍柱,上海七海复泰生物科技有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 NP968核酸提取仪、基因扩增热循环仪,西安天隆科技有限公司产品;OSE-470P TGel蓝光凝胶成像仪,北京天根生物科技有限公司产品;精骐恒温振荡器,苏州捷美电子有限公司产品;Flash Max 850型光吸收酶标仪,上海闪谱生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 参考NCBI上收录的牛轮状病毒VP6基因序列(JN790188.1),使用Primer 5.0进行特异性引物的设计(表1)。

表1 VP6基因引物序列Table 1 Primer sequences of VP6 gene

1.2.2 VP6基因克隆及重组质粒构建 使用DNA/RNA提取试剂盒并借助NP968核酸提取仪进行牛轮状病毒阳性病料基因组的抽提,并以得到的RNA为模板,进行VP6基因的扩增。RT-PCR反应体系为:2×One Step Mix 10 μL,One Step Enzyme Mix 1 μL,VP6-F/VP6-R各1 μL,RNA模板2 μL,RNase-free ddH2O补足至20 μL。RT-PCR反应程序为:50 ℃ 30 min;95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,51 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共30个循环;72 ℃ 10 min进行延伸。对目的片段进行胶回收后,使用NcoⅠ和XhoⅠ对其与Pet-28a空载体进行双酶切,并采用T4 DNA连接酶将二者连接。对重组质粒分别进行双酶切鉴定并进行核酸测序,两者均鉴定为阳性的重组质粒命名为Pet-28a-VP6。

1.2.3 重组VP6蛋白诱导表达条件的优化 将Pet-28a-VP6重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中,通过菌液PCR筛选出阳性表达菌株,表达前先将菌株活化,按照1∶100的比例转接于含有卡那霉素抗性的液体LB培养基中,放置于37 ℃摇床,220 r/min培养1.5 h左右测定其OD 600 nm值,当OD 600 nm值介于0.6至0.8之间时,通过加入不同浓度的IPTG诱导表达,使得IPTG的最终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L,于37 ℃下诱导8 h,离心并收集菌体沉淀,经SDS-PAGE凝胶电泳以确定最佳诱导浓度。并使用最佳诱导浓度在18、25、37 ℃下分别对菌液进行诱导,离心后收集沉淀,经SDS-PAGE凝胶电泳以确定最佳表达温度。

1.2.4 重组VP6蛋白的表达形式分析、纯化及复性 使用优化确定的最适诱导条件,对菌液进行诱导表达,离心收集沉淀,将沉淀重悬后超声破碎,将离心得到的上清液、超声裂解后的上清液与沉淀分别取50 μL,使用2×蛋白上样缓冲液进行制样,通过SDS-PAGE凝胶电泳分析重组VP6蛋白的表达形式。采用镍柱亲和层析的方法对重组VP6蛋白进行纯化,用不同浓度的尿素透析复性重组蛋白,使用BCA蛋白定量方法测定重组蛋白的浓度,分装后置于-80 ℃备用。

1.2.5 重组VP6蛋白的Western blot分析 复性得到的重组VP6蛋白制样后进行PAGE凝胶电泳,将目标区域切下,在半干转膜仪上进行转膜,将膜取下后使用5%的脱脂奶粉封闭2 h,随后在4 ℃下将其置于1∶200稀释的牛轮状病毒阳性血清中孵育12 h,第2天进行洗膜,再使用1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG在室温下孵育1.5 h,滴加ECL发光液至膜上,弃去多余液体后曝光。

1.2.6 间接ELISA检测方法的建立与应用

1.2.6.1 最佳工作条件的确定 采用三因素正交试验来筛选最优条件,分别用1、2、4、8 μg/mL的VP6蛋白包被酶标板;牛轮状病毒阳性及阴性血清的稀释比例分别为1∶50、1∶100、1∶200;酶标二抗的稀释比例分别为1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000。间接ELISA操作步骤参考文献[7],计算试验结果数据P/N值,最终以P/N值最大组的条件确定为抗原包被量、血清和酶标二抗稀释的最佳工作条件。

1.2.6.2 其他试验条件的优化 在确定的最佳工作条件下,以60、90、120 min的时间梯度分别对脱脂奶粉封闭时间、一抗及二抗孵育时间进行优化。以15、30、45 min的时间梯度优化TMB显色时间,最终确定P/N值最大组的时间条件为最适封闭时间、孵育时间和显色时间。

1.2.6.4 特异性试验 在最适工作条件下,以牛轮状病毒阳性血清为阳性对照、SPF牛血清为阴性对照,同时检测牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒与牛呼吸道合胞体病毒阳性血清,评价该方法的特异性。

1.2.6.5 灵敏性试验 对牛轮状病毒阳性血清分别以1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048的比例稀释,评判本试验所建立ELISA检测方法的灵敏性。

1.2.6.6 重复性试验 使用同批次表达并纯化复性得到的重组VP6蛋白进行抗原包被,对不同的3组牛轮状病毒阴阳性血清,重复进行3次检测,根据结果评价其批内重复性;使用3组不同批次表达并纯化复性得到的重组VP6蛋白进行抗原包被,分别对不同的3组牛轮状病毒阴性与阳性血清,重复进行3次检测,评价其批间重复性。

1.2.6.7 临床样本的检测 用本研究建立的牛轮状病毒抗体间接ELISA检测方法,对国家动物血清库保存的云南、山西、内蒙等部分地区牛场的405份牛血清样本进行检测,统计样品中牛轮状病毒抗体阳性率。

2 结果

2.1 VP6基因的扩增及重组质粒构建

以BRV陕西分离株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增VP6基因,得到1 083 bp的基因片段(图1),其大小与预期结果一致。对构建得到的Pet-28a-VP6重组质粒使用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后,得到1 083 bp的目的条带与5 231 bp的剩余载体条带(图2),结果与预期一致,说明重组表达载体Pet-28a-VP6构建成功。

M.DNA标准DL 2 000;1.VP6基因扩增产物;2.阴性对照M.DNA Marker DL2 000; 1.Amplification product of VP6 gene;2.Negative control图1 VP6基因的扩增Fig.1 Amplification of VP6 gene

M.DNA标准DL 5 000; 1.重组载体Pet-28a-VP6经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切M.DNA Marker DL 5 000; 1.Pet-28a-VP6 digested withNcoⅠ and XhoⅠ图2 重组载体双酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion

2.2 重组VP6蛋白表达条件的优化

以不同浓度的IPTG诱导重组菌株进行表达,结果显示,当IPTG最终浓度为1.0 mmol/L时,目的蛋白达到最高产量(图3);在此诱导浓度下,采用不同的温度进行诱导表达,结果表明,在18 ℃条件下表达量最高(图4)。

M.蛋白分子质量标准;1.诱导Pet-28a空载体;2～6.分别为37 ℃下0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG终浓度条件下诱导8h的重组Pet-28a-VP6;7.重组Pet-28a-VP6未诱导M.Protein molecular weight Marker; 1.Induced Pet-28a empty carrier; 2-6.Recombinant Pet-28a-VP6 induced under the conditions of 37 ℃ and 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mmol/L final concentrations of IPTG for 8 h; 7.Uninduced recombinant Pet-28a-VP6图3 不同IPTG诱导浓度下重组VP6蛋白表达量变化Fig.3 Changes of expressions of recombinant VP6 protein at different induction concentrations of IPTG

M.蛋白分子质量标准;1-3.Pet-28a-VP6在18、25、37 ℃下诱导表达;4.Pet-28a-VP6未诱导M.Protein molecular weight Marker; 1-3.Pet-28a-VP6 induced expressions at 18,25,37 ℃;4.Uninduced recombinant Pet-28a-VP6图4 不同温度下重组VP6蛋白表达量变化Fig.4 Changes of recombinant VP6 protein expressions at different temperatures

2.3 重组VP6蛋白的表达形式分析及纯化

在上述确定的最适条件下诱导表达重组菌株,并收集菌体,用SDS-PAGE凝胶电泳进行检测,结果显示,重组VP6蛋白主要在超声裂解后的沉淀中大量存在,使用镍柱纯化,得到的目的蛋白大小为40 ku(图5)。

M.蛋白分子质量标准;1.菌液上清;2.超声裂解液上清;3.超声裂解菌体沉淀;4.纯化VP6蛋白M.Protein molecular weight Marker; 1.Bacterial supernatant of Pet-28a-VP6; 2.Bacterial supernatant of Pet-28a-VP6 ultrasonic lysis;3.Bacterial precipitate of Pet-28a-VP6 ultrasonic lysis; 4.Purified VP6 protein图5 重组VP6蛋白的表达形式分析及纯化Fig.5 Expression analysis and purification of recombinant VP6 protein

2.4 重组VP6蛋白的Western blot鉴定

用BRV阳性血清作为一抗对纯化后的重组VP6蛋白进行 Western blot分析,于40 ku处出现一条清晰的特异性的条带,表明重组VP6蛋白可以被BRV阳性血清特异性识别,即具有反应原性(图6)。

M.蛋白分子质量标准;1、2.重组VP6蛋白;3.阴性对照M.Protein molecular weight Marker; 1,2.Recombinant VP6 protein; 3.Negative control图6 重组VP6蛋白的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of recombinant VP6 protein

2.5 最佳工作条件的确定

经过三因素正交试验可知,当重组VP6蛋白的抗原包被浓度为4 μg/mL,血清以1∶50比例稀释,酶标二抗以1∶10 000比例稀释时P/N值最高,将其确定为最佳工作条件(表2)。

表2 抗原包被浓度、血清及酶标二抗稀释比例的确定Table 2 Determination of antigen coating concentration and dilution ratio of serum and enzyme-labeled secondary antibody

2.6 其他试验条件的优化

在确定的最佳工作条件下进行试验,结果表明,封闭效果最优为5%的脱脂奶粉封闭60 min,一抗牛轮状病毒阳性血清最佳孵育时间为60 min,兔抗牛酶标二抗最适孵育时间为60 min,TMB最佳显色时间为30 min,并以此为工作条件,进行后续试验。

2.7 阴阳性临界值的确定

2.8 特异性试验结果

采用上述试验确定的最适条件,对牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒与牛呼吸道合胞体病毒阳性血清进行交叉试验,结果显示,阴性和阳性对照成立,且这3种病毒阳性血清OD 450 nm值均小于0.233,为VP6蛋白阴性,表明所建立的方法特异性良好。

2.9 灵敏性试验结果

对牛轮状病毒阳性血清分别以1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048比例稀释,同时设置阴性和阳性对照,结果显示,在对照组成立的前提下,当牛轮状病毒阳性血清稀释至1∶1 024时,OD 450 nm值为0.259,仍大于临界值,即为本方法稀释血清的最低阈值,说明该方法具有较好的灵敏性。

2.10 重复性试验结果

采用本试验确定的最适条件,分别进行批内试验和批间试验,结果显示,变异系数分别为3.8%～4.4%和3.8%～6.3%,变异系数均不超过10%,表明此方法重复性良好,结果稳定。

2.11 临床样本的检测结果

采用本试验所建立的牛轮状病毒抗体间接ELISA检测方法,对采自云南、山西、内蒙等部分地区牛场的405份牛血清样本进行牛轮状病毒抗体阳性情况检测,结果检出70份血清样本呈牛轮状病毒抗体阳性,阳性率为17.3%。

3 讨论

轮状病毒是一种人畜共患病原,能够危害人和多种动物的健康,是全球频发的疫病之一,给世界范围内的畜牧业和经济造成了严重的损失。牛轮状病毒是造成犊牛腹泻的主要病原之一,该病毒包装机制复杂,致病力较强,给卫生防控带来了较大的难度[8];同时由于牛轮状病毒具有一定的环境抵抗力,对于养殖场的彻底净化造成了困难[9],并可在不同物种间进行传播,进而引起相关症状。该病毒在我国分布较为广泛,并呈季节性发病,当规模化牛场感染牛轮状病毒后,将导致每年反复发病[3]。因牛轮状病毒存在多种不同的血清型和基因型[10],为疫苗开发带来了较大的困难,所以注重该病的检出能为控制病毒的暴发起到至关重要的作用。

近些年来,不断有学者建立不同的ELISA检测方法,对我国的牛轮状病毒流行情况进行调查。从2008年开始,曹竹婷等[11]使用牛轮状病毒标准株NCDV作为包被抗原建立了检测牛轮状病毒抗体的间接ELISA。随着牛轮状病毒研究的不断深入,发现牛轮状病毒VP6蛋白的氨基酸序列在不同的基因型或血清型间保守性较高[12],且研究报道验证VP6蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。张怡婷等[13]通过牛轮状病毒标准株NCDV扩增VP6基因,使用该基因构建载体,成功表达了重组VP6蛋白,提供了一种简单快捷检测牛轮状病毒的方法。在2022年,吴畏等[14]采用HPR标记的VP6重组蛋白作为包被抗原,建立了一种双抗原夹心ELISA以检测牛轮状病毒。牛轮状病毒主要功能区域位于105-328位点之间,而122-147位点为氨基酸主要聚合区域,参考A组哺乳动物轮状病毒VP6蛋白的免疫优势位点(32-64、155-167、208-274、380-397)[15],本试验设计了特异性引物对其基因片段进行扩增,成功构建了原核表达载体Pet-28a-VP6,使用BL21感受态细胞表达VP6重组蛋白,经镍柱纯化后得到的重组VP6蛋白在Western blot鉴定中呈现良好的反应原性,为后续建立间接ELISA奠定了基础。

通过以牛轮状病毒VP6重组蛋白为基础建立的间接ELISA检测方法,对于牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒与牛呼吸道合胞体病毒阳性血清不存在交叉反应,稀释血清的最低阈值可达1∶1 024,重复性试验的批内批间变异系数均不超过10%,表明该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。用所建立的牛轮状病毒抗体间接ELISA检测方法对中国动物卫生与流行病学中心国家动物血清库保存的405份牛血清样品进行随机检测,共检出70份牛轮状病毒抗体阳性血清,即牛轮状病毒VP6蛋白抗体阳性率为17.3%。本研究所建立的牛轮状病毒抗体间接ELISA检测方法,为今后调查牛轮状病毒流行情况提供了一种有效的、可供选择的血清学检测技术。