北京地区猫杯状病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

张中华,纪志辉,赵 晓,苏煜智,董 昊,司永芳,王金明,石文达*

(1.中瑞动检(北京)生物技术有限公司,北京 102629;2.泰州博莱得利生物科技有限公司,江苏泰州 225300)

猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)属于杯状病毒科水疱性病毒属,是感染家猫及野生猫科动物的常见病原体之一。FCV为单股、正链的RNA病毒,无囊膜,直径为35～39 nm,衣壳由32个中间凹陷的杯状颗粒组成,这些颗粒由90个壳粒以T=3 20面体对称形式组成。基因组大小约为7.7 kb,共有3个开放阅读框(open reading frame,ORF),其中ORF2大小约2.0 kb,主要编码FCV的结构蛋白即衣壳蛋白,其最初编码约75 ku的衣壳蛋白前体,后经蛋白酶加工切除N端124个氨基酸,形成62 ku的成熟衣壳蛋白VP1[1]。

自1957年Fastier从新西兰的1只猫中首次分离得到FCV,又相继在狮子、老虎及猎豹等猫科动物体内分离到该病毒,且在欧洲、美洲、亚洲都有发现,目前已呈世界性分布[2-4]。并且2009年Martino B等[5]从患有肠炎的幼犬肛拭子中也分离到该病毒,表明FCV具有跨种间传播的风险。FCV在猫群中高度流行,引起一种高度传染性的呼吸道疾病,感染后会引发口腔溃疡、发热、打喷嚏、鼻炎、结膜炎等症状[6-7]。多数临床健康猫可长期向外排毒,该病发病率较高,死亡率较低。目前,疫苗接种是预防本病最有效方法,当前国内外广泛应用的疫苗株为255株、F9株等。由于FCV为RNA病毒,极易发生变异,导致现有疫苗的保护效果并不理想,对猫及猫科珍稀野生动物的生存和健康造成了极大的威胁。

本研究通过收集2016-2022年4月北京地区多家宠物医院就诊疑似感染FCV的猫眼鼻咽拭子进行RT-PCR检测和分离培养,对2018-2022年4月收集的鼻咽拭子进行FCV阳性率分析,对分离到的5株FCV进行病毒含量测定、VP1基因序列分析,并对其中1株进行致病性试验,为了解FCV在国内的变异情况及本土疫苗研发提供了科学依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料及试验用动物 病料来自2016-2022年4月北京地区各宠物医院疑似感染FCV猫的眼、鼻、咽拭子,患病猫临床表现多为眼、鼻、口腔分泌物增多、打喷嚏,患病严重猫伴有口腔溃疡;F81细胞,由北京博莱得利生物技术有限责任公司保存并提供;蓝猫,2～3月龄,FCV、FPV、FHV抗原阴性,FCV抗体中和效价≤1∶2,购自固安某宠物市场。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基,美国Gibco公司产品;牛血清,兰州民海生物工程有限公司产品;胰蛋白酶,美国Hyclone公司产品;病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒,北京全式金生物技术有限公司产品;反转录试剂盒、ExTaq酶、Primer STAR GXL Premix,宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 生物安全柜(BSC-LIIA2),北京东联哈尔仪器有限公司产品;医用冷藏冷冻冰箱(YCD-265),澳柯玛股份有限公司产品;CO2培养箱、超速离心机、梯度PCR扩增仪,赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病料的RT-PCR检测 参照GenBank中发布的FCV HRB-SS株(登录号:KM016908)、猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV)JL-04/16株(登录号:MF541125)和猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus type 1,FHV-1)FHV CH-B株(登录号:MT813047)设计引物,用于鉴定FCV、FPV和FHV,引物由北京擎科生物技术有限公司合成。鉴定引物序列信息见表1。

表1 引物序列信息Table 1 Sequence information of primers

按DNA/RNA提取试剂盒说明书要求提取病料中的DNA/RNA,并按反转录试剂盒说明书要求将RNA反转录为cDNA。以cDNA和DNA为模板进行PCR鉴定。

1.2.2 FCV的分离与鉴定 取经核酸鉴定仅FCV阳性的眼、咽拭子液充分振荡混匀后,经8 000 r/min离心8～10 min,取上清经0.22 μm过滤除菌后接种至单层F81细胞,并加入含2%牛血清的DMEM培养液,置37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱培养观察,当细胞病变(CPE)达到80%时收毒。置-70 ℃保存备用。

1.2.3 病毒含量测定 取病毒液用含2%牛血清的DMEM培养液作10倍系列稀释,取10-6～10-12稀释度接种至96孔板,每个稀释度接种6孔,100 μL/孔,观察3～5 d,记录细胞病变情况,计算各稀释度出现病变的百分率。按Reed-Muench法计算病毒含量(TCID50)。

1.2.4 VP1基因PCR扩增及序列分析 参照GenBank中发布的FCV 3786株(登录号:JX519209)设计用于扩增VP1基因的引物,引物由北京擎科生物技术有限公司合成。VP1基因引物信息见表2。以cDNA作为模板用于PCR扩增,PCR产物送北京擎科生物技术有限公司进行测序。测序结果用DNA Star.Lasergene.v7.1中的MegAlign与GenBank中收录的国内外其他FCV毒株及疫苗株(表3)的VP1基因序列进行同源性比较,并使用MEGA7.0软件建立VP1基因氨基酸进化树。

表2 VP1基因引物信息Table 2 VP1 gene primer information

表3 FCV参考毒株信息Table 3 FCV reference strain information

1.2.5 FCV BJH13株致病性试验

1.2.5.1 临床观察 选择2～3月龄抗原抗体符合要求的健康蓝猫10只,分为攻毒组和对照组,5只/组。攻毒组试验猫接种BJH13 F3代病毒液(病毒含量为108.6TCID50/mL),2.0 mL/只(滴鼻和口服各1.0 mL,对照组不作任何操作,各组隔离饲养。持续观察试验猫精神状态、食欲、眼鼻分泌物、口腔溃疡和体温、体重变化等症状至攻毒后14 d。

1.2.5.2 组织病理学检查 分别于攻毒后14 d取感染FCV的猫舌、肺组织,固定于10%中性福尔马林缓冲液,经脱水、透明、包埋、切片,然后进行苏木素-伊红(HE)染色,显微镜下观察并记录病理变化。

2 结果

2.1 病料的PCR检测结果

本研究仅统计2018-2022年4月从北京地区各宠物医院收集到4 798份疑似感染FCV猫的眼、鼻、咽拭子。病料的FCV核酸鉴定结果见表4。结果显示,2018-2022年4月阳性率分别为36.98%、34.30%、41.33%、40.46%和34.39%,总阳性率为37.93%。

表4 病料的FCV核酸鉴定结果Table 4 FCV nucleic acid identification results of diseased materials

2.2 FCV的分离鉴定

选取FCV阳性样品经FCV、FPV、FHV PCR鉴定仅FCV阳性的样品接种至F81细胞,约18～24 h后细胞出现聚缩成团、脱落、葡萄串样典型病变(图1)。提取病毒液上清中的核酸,以cDNA和DNA为模板,经FCV、FPV、FHV特异性引物进行PCR扩增,电泳结果表明,仅FCV呈阳性(图2)。

A.FCV感染后的F81细胞;B.正常的F81细胞A.F81 cells infected with FCV; B.Normal F81 cells图1 FCV分离病毒在F81细胞繁殖第1代产生的CPEFig.1 CPE of isolated virus on F81 cells

M.DNA标准DL 2 000;1、4、7.病毒液上清;2、5、8.阴性对照;3.FCV阳性对照;6.FPV阳性对照;9.FHV阳性对照M.DNA Marker DL 2 000; 1,4,7.Viral fluid supernatant; 2,5,8.Negative control; 3.FCV positive control; 6.FPV positive control; 9.FHV positive control图2 FCV分离株PCR产物电泳分析Fig.2 Electrophoresis analysis of PCR products of FCV BJH13 strain

2.3 FCV 5个毒株的病毒含量测定

FCV分离株中的5个毒株,BJH13株、BJH24株、BJH25株、BJH30株、BJH36株F3代的病毒含量分别为108.6、109.4、109.7、108.4TCID50/mL和107.3TCID50/mL。

2.4 VP1基因PCR扩增

将FCV分离株病毒液PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳,扩增出约2 288 bp左右的目的条带,与预期目的条带一致(图3)。

M.DNA标准DL 5 000;1.病毒液上清;2.阴性对照M.DNA Marker DL 5 000;1.Viral fluid supernatant; 2.Negative control图3 VP1基因PCR产物电泳分析Fig.3 Electrophoresis analysis of VP1 gene PCR product

2.5 FCV 5个毒株VP1基因遗传进化分析

经测序及序列分析,VP1基因片段大小约为2 007 bp。用DNA Star.Lasergene.v7.1中的MegAlign软件、MEGA7软件分别对BJH13株(2016年分离)、BJH24株(2021年分离)、BJH25株(2021年分离)、BJH30株(2022年分离)、BJH36株(2022年分离)和其他FCV参考毒株VP1基因序列进行同源性比较及建立氨基酸进化树(图4)。同源性比较结果显示,5株FCV分离株VP1基因核苷酸和氨基酸同源性分别为74.1%～85.4%和83.6%～91.0%;5株FCV分离株与其他国内外参

△.本研究分离株;○.疫苗株△.The isolated strains from this study; ○.The vaccine strain图4 VP1基因氨基酸进化树Fig.4 Amino acid phylogenetic tree of VP1 gene

考毒株核苷酸和氨基酸同源性分别为73.4%～85.5%和81.2%～94.0%,与国内疫苗株255株核苷酸和氨基酸同源性分别为74.8%～84.5%和83.7%～91.6%,与国外疫苗株F9株核苷酸和氨基酸同源性分别为74.7%～79.7%和84.6%～89.7%。氨基酸进化树结果显示,2018年分离的BJH13株与国内毒株WZ-1株、XH株、HRB-SS株在同一小分支上,遗传距离较近;2021-2022年分离的BJH24株、BJH25株、BJH30株和BJH36株和其他国内外参考毒株遗传距离较远;与国内疫苗株255株、国外疫苗株F9株在不同的小分支上。

2.6 BJH13株致病性试验

2.6.1 临床观察 攻毒组试验猫在攻毒后第3天陆续出现精神沉郁、食欲减退、体温升高、眼鼻分泌物增多;第5～6天出现舌泛红、溃疡典型感染FCV临床症状;第9天有1只猫死亡,第10日个别猫出现明显呼吸啰音;至观察期结束,攻毒组试验猫减重均达20%以上;攻毒组试验猫100%(5/5)出现FCV典型临床症状。对照组试验猫精神状态、食欲、体温均正常,体重均有增加,无可见眼、鼻分泌物及舌溃疡症状(图5)。

A.眼、鼻出现分泌物;B.舌溃疡;C.正常猫;D.正常猫舌A.Discharge from eyes and nose; B.Tongue ulcer; C.Normal cat; D.Normal cat tongue图5 试验猫临床症状Fig.5 Clinical symptoms of cats

2.6.2 BJH13株组织病理学检查 舌、肺组织切片经HE染色后,显微镜下可观察到舌上皮有局灶性扩张性的溃疡,溃疡边缘的鳞状上皮细胞有空泡化和坏死,溃疡表面有大量坏死物质及纤维素渗出,溃疡下有中性粒细胞浸润(图6A)。肺脏主要呈局灶性间质性肺炎,部分区域肺泡壁毛细血管扩张充血,肺泡内有大量红细胞,并见淋巴细胞、单核细胞渗出、增生(图6B),肺泡间隔增宽(图6C),肺泡腔变狭窄或消失(图6D)。

A.攻毒组试验猫舌组织病理照片;B、C、D.攻毒组试验猫肺组织病理照片A.Histopathological section of tongue of cats in the challenge group; B,C,D.Histopathological sections of lung of cats in the challenge group图6 试验猫舌和肺组织病理学变化Fig.6 Histopathological lesions of tongue and lung in experiment cats

3 讨论

本研究通过FCV分离株BJH13株致病性试验结果表明,猫感染FCV后,病变局限在口腔黏膜、扁桃体和肺部[6-7],剖检发现,该病毒侵染部位主要集中在口腔和肺部,通过组织病理学检查肺脏主要呈局灶性间质性肺炎,肺脏部分区域肺泡壁毛细血管扩张充血,肺泡内有大量红细胞,并见淋巴细胞、单核细胞渗出、增生,肺泡间隔增宽,肺泡腔变狭窄或消失,管腔内有少量脱落的上皮细胞。进一步证实FCV主要侵染宿主动物的上呼吸道及相关黏膜组织。

目前,疫苗接种是预防本病的主要手段,随着国内宠物行业养猫热兴起,对猫用预防用生物制品的需求量大幅增加。目前,国内仅有一款进口猫三联灭活疫苗(妙三多)获批使用,其FCV疫苗株为255株。本研究将BJH13株、255株(疫苗株)分别与2015-2020年国内分离的参考毒株VP1基因核苷酸和氨基酸同源性进行比较,5株FCV分离株VP1基因与疫苗株255株、F9株核苷酸和氨基酸同源性分别为74.7%～84.5%和83.7%～91.6%。王洁等[8]对京津地区分离到的5株FCV进行VP1基因与疫苗株255株、F9株核苷酸和氨基酸同源性分别为73.4%～77.4%和82.5%～86.4%。由此表明,近年来疫苗保护率下降,可能与国内FCV基因序列变异与疫苗株同源性降低有一定关联。通过对BJH13株进行致病性试验,结果表明猫感染BJH13株后临床表现为典型FCV症状,可用于今后FCV攻毒发病模型的建立。同时,本研究分离的5株分离株可作为近年来FCV本土流行代表毒株,可为研制本土化猫用疫苗提供候选毒株。