加味强壮散对白羽肉鸡血清抗氧化及免疫功能的影响

任思羽,纪 鹏,魏彦明,刘文娟,武凡琳,华永丽,任建明,李琛琛,杨昊赤

(甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070)

中药含有大量多糖、生物碱、黄酮、微量元素、矿物质等物质,其作为饲料添加剂不仅为畜禽提供营养,同时对于动物疾病预防有积极作用[1]。现如今,饲料中添加大量抗菌药物导致细菌耐药性不断提高、动物源产品和环境中的抗菌药物残留等问题日益严重。2020年7月1日,我国农业农村部提出“饲料端禁抗、治疗端限抗减抗”的要求,全面禁止使用含有促生长类药物及抗菌药物。而中药凭借其天然性、毒副作用小、不易产生耐药性、不易产生残留等特点而备受关注[2]。加味强壮散为课题组自拟的健脾消导中药复方,可补益脾胃、增强胃肠机能、促进消化吸收等。有报道显示,肉鸡基础饲粮中添加适量中药复方能够改善肉鸡的抗氧化能力[3]。

自20世纪80年代以来,白羽肉鸡养殖已成为我国农业产业化发展过程中最迅速、最典型的行业之一[4]。但是各种环境因素产生的应激严重影响了肉鸡健康,使白羽肉鸡养殖利润明显下降。本研究旨在分析饲粮中添加不同水平的加味强壮散对白羽肉鸡抗氧化功能和免疫球蛋白及脏器组织形态结构的影响,以此筛选出加味强壮散在白羽肉鸡饲粮中的最适添加水平,为白羽肉鸡养殖中使用中药作为饲料添加剂提供新思路与新方法,同时也为加味强壮散用于白羽肉鸡健康养殖提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药物 党参、六神曲、麦芽、山楂、黄芪、茯苓、白术等11味中药,均购自兰州市黄河药材批发市场。按比例混和粉碎、过筛、混匀后制成加味强壮散[5]。

1.1.2 试剂 超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(生产批号:20211227)、总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒(生产批号:20211225)、丙二醛(MDA)试剂盒(生产批号:20211227)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒(生产批号:20211227),南京建成生物工程研究所产品;免疫球蛋白IgA、IgG、IgM含量测定试剂盒,上海酶联生物技术公司产品。

1.1.3 试验用动物与饲料 1日龄白羽肉鸡,购自山东大成集团;正大510小鸡饲料(开食至22日肉小鸡)和正大511中鸡饲料(22日龄后至肉中鸡),兰州正大集团产品。

1.1.4 主要设备 电子秤,厦门佰伦斯电子科技有限公司产品;JA2003电子精密天平,上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品;YP502N电子天平,上海天美天平有限公司产品;HH-S型数显恒温水浴锅,金坛市恒丰仪器厂产品;WH861漩涡混合器,上海康华生化仪器制造厂产品;ASP300 S全封闭组织脱水机、HistoCore Arcadia H组织学石蜡包埋机、HistoCore MULTICUT半自动切片机,德国徕卡公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物试验与样本采集 试验选择1日龄初始体重相近的健康白羽肉鸡88只,随机分为4组。分别为1个空白对照组(C组),饲喂基础饲粮;3个试验组,在基础饲粮中添加0.2%、0.4%、0.8%的加味强壮散,为低剂量组(L组)、中剂量组(M组)、高剂量组(H组)。对照组2个重复,试验组3个重复,每个重复8只鸡。试验期为42 d。各组肉鸡在同一鸡舍错位叠笼饲养,采用乳头式饮水器供水,人工投料,每日清粪,保持鸡舍内通风换气,并按照常规免疫程序进行免疫。饲料由豆油、谷物及其加工产品、油料籽实及其加工产品、石粉、氯化钠、维生素、矿物质元素及其络合物、氨基酸、氨基酸盐类及其类似物等组成,配方比例涉及正大公司专利,暂未公开。基础饲粮营养水平见表1与表2。试验结束后,空白对照组每个重复随机挑选6只鸡,试验组每个重复随机挑选4只鸡,每组共12只。采血静置后,3 000 r/min离心15 min,将血清分装到灭菌EP管中,置于-80 ℃冷冻保存备用。然后采集肉鸡的肝脏和脾脏,用10%中性福尔马林液固定。

表1 正大510小鸡饲料营养水平Table 1 Nutrient composition of Zhengda 510 chick feed %

表2 正大511中鸡饲料营养水平Table 2 Nutrient composition of Zhengda 511 chick feed %

1.2.2 抗氧化功能测定 按照说明书要求操作,测定血清中超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)与谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的含量。

1.2.3 血清免疫球蛋白测定 利用“1.2.2.”项所制备的血清,按照酶联免疫吸附法分别测定血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM的含量。

1.2.4 脏器组织形态观察 固定样本经洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋等处理后,在室温下切成3.5 μm蜡片,苏木精-伊红(HE)染色,中性树胶封片,采用生物显微镜观察组织形态学变化。

1.2.5 数据处理与分析 试验数据采用Excel 2016、GraphPad Prism 8.0.2软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),采用Tukey's法对各组平均值进行多重比较,结果以“平均值±标准差”表示,P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 添加不同水平的加味强壮散对白羽肉鸡抗氧化功能的影响

由表3可知,与C组相比,H组显著提高了白羽肉鸡的T-AOC、GSH-PX活力(P<0.05),分别提高了49.64%、29.94%;且显著降低了MDA含量(P<0.05),降低了5.26%。

表3 饲料添加加味强壮散对白羽肉鸡血清抗氧化指标的影响Table 3 Effect of Jiawei Qiangzhuang powder on the serum antioxidant indexes of white-feather broilers

2.2 添加不同水平的加味强壮散对白羽肉鸡血清免疫球蛋白含量的影响

由表4得知,与C组相比,H组白羽肉鸡血清中IgA和IgM的含量显著提高(P<0.05),分别提高了25.46%、38.45%。

表4 饲料添加加味强壮散对白羽肉鸡血清免疫球蛋白含量的影响Table 4 Effect of Jiawei Qiangzhuang powder on the serum immunoglobulin contents of white-feather broilers μg/mL

2.3 添加不同水平的加味强壮散对白羽肉鸡脏器组织形态结构的影响

肝脏组织显微结构见图1。由图1可知,C组肝细胞发育良好,肝血窦较明显,肝小叶中央静脉扩张,组织内有部分血细胞。加味强壮散各试验组肝组织均表现正常形态,肝小叶中央静脉扩张,但未见明显血细胞,可见肝血窦内皮枯否氏细胞数量较对照组增多,体积增大,呈不规则多边形,同时见肝血窦增大。

C.对照组;L.低剂量试验组;M.中剂量试验组;H.高剂量试验组C.Control group; L.Low dose test group; M.Medium dose test group; H.High dose test group图1 饲料添加加味强壮散对白羽肉鸡肝脏组织形态结构的影响(HE,200×)Fig.1 Effect of Jiawei Qiangzhuang powder on liver histological structure of white-feather broilers(HE,200×)

脾脏组织显微结构见图2。由图2可知,与C组相比,H组脾小体数量增多,淋巴细胞多且排列紧密,白髓占比较大。

C.对照组; H.高剂量试验组C.Control group; H.High dose test group图2 饲料添加加味强壮散对白羽肉鸡脾脏组织形态结构的影响(HE,100×)Fig.2 Effect of Jiawei Qiangzhuang powder on spleen histological structure of white-feather broilers(HE,100×)

3 讨论

3.1 加味强壮散水平对白羽肉鸡抗氧化功能的影响

正常生理状况下,机体主要依靠酶系和非酶系内源性自由基清除剂及外源添加剂来抵消或清除体内自由基,以维持机体自由基动态平衡,其中常见的抗氧化酶包括SOD、GSH-Px等[6]。GSH-Px和SOD构成机体的酶促抗氧化体系,在合理范围内二者活性越高,机体抗氧化应激的能力越强;GSH-Px是动物机体内过氧化氢等的清除剂,其活性直接反映了动物机体的抗氧化能力[7-8];MDA为细胞膜脂质过氧化的终产物,可参照其含量来间接估计机体所受氧化损伤的程度;T-AOC是体现机体抗氧化能力的综合指标[9]。王佳敏等[10]研究发现,饲粮中添加黄芪复方颗粒可以有效提高肉鸡抗氧化能力。郭艳丽等[11]研究表明,红芪、党参复方添加剂能提高肉鸡的抗氧化能力和细胞免疫功能。周凌博等[12]研究发现,通过将黄芪、丹参、甘草、淫羊藿、白术按照复方中草药配合比例混合后,添加到黄羽肉鸡的基础饲粮中可以显著提高肉鸡血清SOD和T-AOC含量。本试验结果表明,饲料添加0.8%加味强壮散显著降低了白羽肉鸡血清MDA含量、显著增高了GSH-Px、T-AOC含量。表明该中药复方及有效成分可以增强肉鸡的抗氧化应激能力,减少机体内自由基含量,降低机体受氧化损伤的程度,从而增强白羽肉鸡的抗氧化能力。

3.2 加味强壮散水平对白羽肉鸡血清免疫球蛋白含量的影响

免疫球蛋白是动物体液免疫的主要免疫分子,在机体免疫系统中发挥重要作用[13]。血清免疫球蛋白含量能够反应机体免疫功能变化。IgG主要由免疫器官浆细胞分泌,是介导体液免疫的关键免疫球蛋白,血清中含量较高;IgM是体液免疫过程中最先被分泌、释放的免疫物质,能与体内和体外抗原相互反应,消除病原体[14];IgA是在胃肠淋巴组织中合成的,分为血清型和分泌型两种,是防止病原体入侵机体的第一道防线[15]。范天宝[16]研究发现,饲料添加1%复方黄芪可以显著提高肉鸡免疫球蛋白IgA、IgG和IgM含量。王浩男[17]研究发现,添加槲皮万寿菊素可显著提高42 d肉仔鸡血清免疫球蛋白IgG含量。王佳丽等[18]研究表明,将刺五加、麦芽、炒山楂、贯众、苍术和五味子等混合制成复方中药制剂,发现饲粮中添加复方中草药制剂可提高肉仔鸡的免疫球蛋白含量。蒋慧等[19]研究发现,肉鸡基础饲粮中添加0.2%山楂粉可以显著提高肉鸡血清总蛋白含量。本试验发现在日粮中添加0.8%加味强壮散时,可显著提高白羽肉鸡血清中免疫球蛋白IgA和IgM的含量,表明加味强壮散可以促进肉鸡免疫球蛋白的分泌,增强体液免疫水平。

3.3 加味强壮散水平对白羽肉鸡肝脏与脾脏组织形态结构的影响

肝脏是机体内最大的代谢和解毒器官,具有分泌胆汁、贮存养分、免疫防御、造血、再生、解毒、代谢等一系列重要功能;脾脏属于机体外周免疫器官。肝脏、脾脏的健康情况直接决定了肉鸡的健康水平。李树鹏等[20]研究发现,饲料添加黄芪多糖益生菌合生元可以增强肝脏机能,而且对免疫器官生长发育有促进作用。曹楠等[21]研究表明,饲粮中添加400 mg/kg白术多糖可以促进岭南黄鸡免疫器官的生长发育。张泽强等[22]研究发现,将党参、黄芪、丹参、当归、川芎、何首乌等中药混合制备成中药免疫增强剂,添加到肉鸡日粮中可提高各免疫器官的脏器指数。本研究发现加味强壮散试验组白羽肉鸡的肝细胞发育更好,肝血窦变大,肝血窦内皮枯否氏细胞数量增加,说明加味强壮散促进了肝脏的造血与储血能力,从而增强了机体的代谢和免疫功能。脾脏组织学观察结果显示,加味强壮散高剂量组脾小体数量增多,淋巴细胞多且排列紧密,白髓占比较大,说明饲料添加0.8%加味强壮散明显增强了脾脏功能。

综上所述,加味强壮散可以增强白羽肉鸡的抗氧化能力,增加白羽肉鸡血清中免疫球蛋白的含量,并且增强了肝脏功能,促进免疫器官发育。添加0.8%的加味强壮散可显著增强白羽肉鸡的抗氧化性能,显著增加血清中免疫球蛋白IgA和IgM的含量,增强了脾脏功能。综合分析认为,添加0.8%加味强壮散的饲喂效果最佳。