HPLC 法测定金钱草中紫云英苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素

吴凡，黄昌晶，李洁，程丹，张伟，徐步斌，周斌

江西科技师范大学 药学院，江西 南昌 330013

金钱草为报春花科植物过路黄LysimachiachristinaeHance 的干燥全草，具有利湿退黄、利尿通淋、解毒消肿等功效[1]。金钱草中主要化学成分有黄酮、多糖等[2-5]。药理研究表明，金钱草具有抗炎镇痛、利尿排石等作用[6-9]。目前对金钱草中化学成分分离、提取物的药理作用研究较多，对药材中多种活性成分检测报道较少[10-11]。本实验建立HPLC-UV 法测定金钱草中5 种黄酮类成分紫云英苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素，为金钱草药材的质量控制和进一步开发利用提供参考。

1 仪器与试药

TU-1950 双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；1100 高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；CP225D 分析天平，天津市泰斯特仪器有限公司；XMTD203 恒温水浴锅，江苏中大仪器科技有限公司；JC101 电热鼓风干燥箱，上海成顺仪器仪表有限公司；KQ-200VDE 型双频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

金钱草药材采集于四川省，批号S1～S4，经江西中医药大学邓可众教授鉴定为报春花科植物过路黄Lysimachia christinaeHance 的干燥全草，标本存放于江西科技师范大学药学院。紫云英苷对照品（成都埃法生物科技有限公司，批号AZ2111353，质量分数≥98%）；山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品（成都埃法生物科技有限公司，批号AF21092904，质量分数≥98%）；槲皮素对照品（北京索莱宝科技有限公司，批号SQ8030，质量分数≥98%）；山柰酚对照品（北京索莱宝科技有限公司，批号SK8030，质量分数≥98%）；异鼠李素对照品（成都植标化纯生物技术有限公司，批号Z20105，质量分数≥98%）；甲醇（批号B2106011，色谱纯）、磷酸（批号100106，分析纯）、盐酸（批号1908051，分析纯）均购自西陇化工股份有限公司；娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Eclipse XDB-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm），流动相为甲醇（A）-0.4%磷酸水（B），梯度洗脱（0～5 min，30%～45% A；5～15 min，45%～60% A；15～20 min，60%～60.1% A；20～25 min，60.1%～80% A；25～30 min，80%～30% A），检测波长360 nm，体积流量0.5 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL。

2.2 供试品溶液的制备

取金钱草粉末（过100 目筛）约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 mL，精密加入盐酸5 mL，置90 ℃水浴中加热水解1 h，取岀，迅速冷却，转移至50 mL量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取适量紫云英苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素对照品，制备质量浓度分别为0.215、1.060、0.870、0.640、0.240 mg/mL的混合对照品溶液，备用。

2.4 系统适用性试验

分别吸取适量混合对照品、金钱草供试品溶液，进样测定，色谱图见图1。在此色谱条件下，紫云英苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素与其相邻各组分色谱峰分离度大于1.5，理论塔板数均符合要求，供试品中紫云英苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素与混合对照品保留时间一致。

图1 混合对照品（A）和金钱草（B）的HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of mixed reference substances (A) and Lysimachia christinae (B)

2.5 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液适量，分别置于10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，配制成不同质量浓度的混合对照品溶液（含紫云英苷176.80、132.60、88.40、44.20、22.10 μg/mL，山柰酚-3-O-芸香糖苷169.12、126.84、84.56、42.28、21.14 μg/mL，槲皮素174.00、130.50、87.00、43.50、17.40 μg/mL，山柰酚408.96、306.72、204.48、102.24、51.12 μg/mL，异鼠李素186.40、139.80、93.20、46.60、23.30 μg/mL）。分别进样测定，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，并以S/N＝3 和S/N＝10 计算检测限（LOD）和定量限（LOQ），结果见表1。

表1 线性关系考察结果Table 1 Results of linear relationship investigation

2.6 精密度试验

精密吸取适量的混合对照品溶液，按以上色谱条件连续进样6 次，测定峰面积，计算得紫云英苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素峰面积的RSD 值分别为0.25%、0.20%、0.13%、0.16%、0.14%。

2.7 稳定性试验

取金钱草（S1）供试品溶液分别于0、2、4、6、8、12、24 h 进样测定，计算得紫云英苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素峰面积的RSD 值分别为0.58%、1.05%、0.33%、0.15%，1.26%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.8 重复性试验

精密称取金钱草（S1）粉末2.0 g，共6 份，制备供试品溶液，进样测定，计算得紫云英苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素质量分数的RSD 值分别为1.55%、1.24%、0.83%、1.39%、2.06%。

2.9 回收率试验

取金钱草（S1）粉末约1.0 g，精密称定，共6份，分别精密加入0.215 mg/mL 紫云英苷、0.265 mg/mL 山柰酚-3-O-芸香糖苷、0.870 mg/mL 槲皮素、0.640 mg/mL 山柰酚和0.240 mg/mL 异鼠李素对照品溶液0.6、0.9、0.7、1.6、0.5 mL，制备供试品溶液，进样测定峰面积，计算加样回收率，结果紫云英苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素的平均加样回收率分别为99.50%、100.39%、99.93%、105.58%、98.96%，RSD 值分别为1.07%、1.44%、0.57%、0.24%、0.65%。

2.10 样品测定

称取金钱草粉末约2.0 g，精密称定，各3 份，制备供试品溶液，进样测定，按外标法计算金钱草中紫云英苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素的质量分数，见表2。

表2 金钱草中紫云英苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素测定结果（n＝3）Table 2 Determination of astragalin,kaemperfol-3-O-rutinoside,quercetin,kaempferol,and isorhamnetin in Lysimachia christinae (n＝3)

3 讨论

因金钱草中黄酮类化合物呈弱酸性，并参考《中国药典》2020 年版一部中金钱草的测定方法，分别考察了甲醇-酸水溶液、乙腈-酸水溶液不同体系的醋酸和磷酸水溶液，最终确定为甲醇-0.4%磷酸水溶液系统梯度洗脱，5 种黄酮类化合物能达到较好的分离。将紫云英苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素5 种对照品溶液和金钱草供试品溶液分别在300～450 nm 波长进行扫描，根据紫外扫描图谱和预实验的结果，选择360 nm 作为金钱草药材中活性成分测定的检测波长。

现代药理研究表明，紫云英苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素具有抗肿瘤、调节脂质代谢和保护神经损伤等药理作用[12-16]，对这些活性成分进行质量分析研究对金钱草的质量控制具有重要的实际意义。本研究建立HPLC 法测定金钱草药材中紫云英苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素5 种有效成分的方法，方法的重复性好，操作简单，结果准确，可以用来控制金钱草药材及其制剂的质量。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突