基于网络药理学和实验验证探讨雷公藤治疗黑色素瘤的作用机制

江婷婷，赵文文，武香香，朱红磊，曾华辉，闫敏，朱鑫*

1.河南中医药大学 药学院，河南 郑州 450046

2.河南中医药大学 中医药科学院，河南 郑州 450046

3.河南中医药大学 信息技术学院，河南 郑州 450046

黑色素瘤通常是指恶性黑色素瘤是黑色素细胞来源的一种高度恶性的肿瘤，多发生于皮肤，也可见于黏膜和内脏，其发病率占皮肤肿瘤第3 位[1]。目前关于预防和治疗黑色素瘤的药物比较匮乏，且效果不理想，5 年生存率不足40%[2]。临床上治疗主要以手术切除为主，辅助放疗、化疗、免疫疗法以及靶向治疗[3-4]。这些方法效果和安全性尚待进一步考察，且治疗费用昂贵[5-6]。因此，近年来人们更加关注从天然植物中寻找预防和治疗黑色素瘤的新途径。

传统中医药理论认为，黑色素瘤属中医“黑疔”“恶疮”“疠疽”等范畴，在临床治疗中以“扶正祛邪、清热解毒、活血化瘀”为主要治则[7]。雷公藤Tripterygium wilfordiiHook.f.为卫矛科木本植物，具有清热解毒、祛风除湿、活血通络、消肿止痛等功效[8]。雷公藤甲素是雷公藤的主要生物活性成分之一，具有有效的抗癌活性[9]，用于治疗炎症、自身免疫和恶性疾病已有数百年历史[10]。雷公藤甲素抗黑色素瘤已有文献报道[11]，称雷公藤甲素对黑色素瘤细胞具有抗增殖、抗侵袭和促凋亡的作用。杨羽等[12]研究表明雷公藤甲素通过抑制趋化因子配体2（CCL2）/趋化因子C-C-基元受体2（CCR2）信号通路调节黑色素瘤细胞的增殖、凋亡和免疫逃逸。然而，目前关于雷公藤甲素治疗黑色素瘤的研究仍处于初级阶段，其潜在靶点及作用机制有待进一步阐明。

中药成分多且复杂，呈现出多组分、多靶点的特征，网络药理学的研究思路与中医药多成分、多靶标、系统调控的理念相一致，其整体性以及注重药物-疾病-靶点相互作用关系的特点与未来中药的发展趋势相吻合[13]。本研究基于网络药理学与分子对接技术筛选雷公藤活性成分治疗黑色素瘤的相关靶点和通路，并将筛选后的活性成分与靶蛋白进行分子对接，采用体外实验验证雷公藤调控相关通路关键靶点作用机制，为探索雷公藤治疗黑色素瘤提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 雷公藤活性成分与靶点筛选

利用中药系统数据库及分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php），检索雷公藤的所有化学成分，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 为筛选条件，得到雷公藤的活性成分和靶点。

1.2 雷公藤作用靶点收集和疾病相关靶点的收集

通过TCMSP 数据库查找雷公藤活性成分对应潜在靶点。利用GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）数据库，输入“melanoma”为关键词进行搜索，去重后，使用UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/）对靶点处理后得到标准名称。

1.3 “药物活性成分-疾病靶点”调控网络构建

将1.2 项下获取的药物活性靶点和疾病靶点进行Venny 2.1 软件进行分析，将其交集靶点再进一步用Perl 脚本处理，得出的Network、MolLists、Type 文件导入Cytoscape 3.7.1 软件进行可视化，构建出“药物活性成分-疾病靶点”网络图。

1.4 蛋白质相互作用（PPI）网络构建及核心靶点筛选

利用String 数据库，进行PPI 分析。以网络中各靶基因的节点degree 值为指标，筛选出网络中的核心蛋白质靶标，R 软件绘制靶点条形图。

1.5 富集功能分析

基于DAVID 6.8 数据库（https://david.ncifcrf.gov/），以P＜0.05 为筛选条件，对交集靶点进行基因本体（GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。利用微生信在线平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）将GO 及KEGG通路富集结果绘制成柱状图和气泡图。

1.6 主要活性成分-核心靶点分子对接

通过蛋白质数据库PDB 和PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载筛选得到的成分和靶蛋白结构，采用AutoDockTools 进行分子对接，使用PyMOL 进行可视化。根据以往文献报道，选取结合能最小的对接模型。

1.7 实验验证

1.7.1 细胞 黑色素瘤B16-F1 细胞，购自于武汉普诺赛有限公司。

1.7.2 试药与仪器 雷公藤甲素（质量分数99%，批号LGTJS20180126，西安昊轩公司）；RPMI1640培养基（批号：31800，北京索莱宝科技有限公司））；胎牛血清（批号42Q9281K，美国Gibco 公司）；CCK-8 试剂盒（批号CA1210，北京索莱宝科技有限公司）；Trizol（批号R1100，北京索莱宝科技有限公司）；BeyoRTTMcDNA 第一链合成试剂盒（批号D7178M，上海碧云天生物技术有限公司）；PCR 引物（苏州金唯智生物科技有限公司）；Green PCR Master Mix（批号A25742，美国Thermo 公司）。

3111 型恒温培养箱（赛默飞世尔科技有限公司）；TG16-WS 型离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；SW-CJ-2F 型超净台（苏州苏洁净化公司）；AL204 型精密电子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；1510-02820C 型酶标仪（美国Thermo公司）；TS100 型倒置显微镜（日本尼康公司）；A00947 型RNA 逆转录仪（美国Thermo 公司）；QuantStudio 7 FleX 实时荧光PCR 仪（美国Thermo公司）。

1.7.3 B16-F1 细胞毒性实验 B16-F1 细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基，以2.5×103个/孔，接种96 孔板，置于37 ℃培养箱过夜，每孔分别加入不同质量浓度（0、2.5、5、10、15、20、25、30 ng/mL）的雷公藤甲素100 μL 作用细胞24 h，按CCK-8 试剂盒说明书进行操作，450 nm 处检测吸光度（A）值，计算细胞活力，另设对照组（无血清培养基）。

1.7.4 荧光定量PCR 检测蛋白激酶B1（Akt1）、血管内皮生长因子A（VEGFA）mRNA 的表达 将细胞分为对照组及不同质量浓度（10、11.36、15 ng/mL）雷公藤甲素处理组，用Trizol 试剂提取各组B16-F1 细胞总RNA，按照试剂盒操作步骤进行逆转录合成cDNA，PCR 扩增。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，再用2-ΔΔCt法求算目的基因的表达量，引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.7.5 统计学方法 使用SPSS 26.0 软件进行实验数据统计学分析，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 结果

2.1 雷公藤活性成分及治疗黑色素瘤潜在靶点

通过TCMSP 数据库检索，筛选出雷公藤51 种成分，成分靶点共121 个。根据degree 值排名，其中主要活性成分7 个，见表2。

表2 雷公藤主要活性成分基本信息Table 2 Basic information of main active ingredients of Tripterygium wilfordii

2.2 药物-疾病交集靶点获取

在GeneCards 和OMIM 疾病数据库中检索有关黑色素瘤的疾病靶点，去重后，得疾病相关靶点7 615 个。利用Venny 分析工具对雷公藤靶点和黑色素瘤靶点取交集，其中与黑色素瘤相关的靶点有100 个，见图1。

图1 雷公藤与黑色素瘤重合的靶点韦恩图Fig.1 Veen diagram of the overlap of Tripterygium wilfordii and melanoma

2.3 “药物活性成分-疾病靶点”网络构建

将交集靶点和筛选的药物活性成分，用Cytoscape 软件构建“药物活性成分-疾病靶点”网络，见图2。药物活性成分中degree 值排前2位的分别是山柰酚（degree＝44）、雷公藤甲素（degree＝32）。

图2 雷公藤活性成分-疾病靶点图Fig.2 Active ingredients of Tripterygium wilfordii -disease target map

2.4 PPI 网络构建及核心靶点筛选

将交集靶点导入String 数据库进行PPI 分析。如图3 所示，PPI 含有100 个靶蛋白和1 092 条互作边。其关键靶点包括Akt1、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、血管内皮生长因子2（VEGF2）、AP-1 转录因子亚基（JUN）、信号传导和转录激活蛋白3（STAT3）等，可能是雷公藤治疗黑色素瘤的关键靶点，绘制成靶点条形图，见图4。

图3 PPI 网络图的构建Fig.3 Construction of the PPI network diagram

图4 核心靶点条形图Fig.4 Bar plots of core targets

2.5 GO 和KEGG 通路富集分析

在GO 富集分析中，富集到436 条生物过程（BP）、52 条细胞组成（CC）、102 条分子功能（MF）条目。以P＜0.05 为筛选条件。取前10 个GO 条目绘制条形图，见图5。

图5 GO 功能富集分析Fig.5 GO functional enrichment analysis

根据DAVID 筛得到KEGG 通路147 条，根据P值排序绘制排名前20 位的KEGG 气泡图，见图6。可预测雷公藤对黑色素瘤的治疗作用主要分布在癌症通路、磷脂酰肌醇-3-羟激酶（PI3K）/Akt、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素（IL）-17、VEGF等信号通路。

2.6 分子对接结果

分子对接结果显示山柰酚、雷公藤甲素与Akt1、PTGS2、VEGFA 核心靶点结合能均小于-5 kcal/mol（1 cal＝4.4 J），表现出较强的结合活性，见表3。提示这2 个活性成分在雷公藤治疗黑色素瘤中起着较为重要的作用，进一步通过PyMol 软件对对接结果进行可视化，见图7。

图7 分子对接图Fig.7 Molecular docking diagram

表3 山柰酚和雷公藤甲素抗黑色素瘤关键靶点结合能Table 3 Prediction of binding energy of key targets of kaempferol and triptolide against melanoma

2.7 实验验证结果

2.7.1 细胞毒性实验 结果显示，雷公藤甲素能够抑制黑色素瘤细胞的生长，并呈浓度相关性，IC50为11.36 ng/mL，见图8。

图8 雷公藤甲素对B16-F1 细胞毒性的影响（，n =4）Fig.8 Effect of triptolide on cytotoxicity of B16-F1 (,n =4)

2.7.2 荧光定量PCR 检测Akt1、VEGFAmRNA 的表达 通过实时qPCR 结果可知给予不同质量浓度10、11.36、15 ng/mL 雷公藤甲素后，Akt1、VEGFAmRNA 表达明显低于对照组（P＜0.01、0.001），见图9。

图9 雷公藤甲素对Akt1、VEGFA mRNA 的表达的影响（，n =3）Fig.9 Effect of triptolide on expression of Akt1 and VEGFA mRNA (,n =3)

3 讨论

本研究通过网络药理学的研究，构建出“药物活性成分-靶点”网络图，进一步明确化学成分与靶点之间的相互作用关系。其中活性成分排在前2位的是山柰酚和雷公藤甲素。因山柰酚在雷公藤中的成分含量较低，不能真正发挥中药在临床上的药用价值，故选取雷公藤甲素作为抗黑色素瘤的主要成分[14]。已有文献表明雷公藤甲素能抑制黑色素瘤细胞的增殖和侵袭[15]。

PPI 网络筛选出核心靶点为Akt1、PTGS2、VEGFA、JUN 等靶点参与多个BP，如炎症、细胞增殖和凋亡等。KEGG 富集结果表明，雷公藤抗黑色素瘤的作用可能与癌症通路、PI3K/Akt、TNF、IL-17、VEGF 等信号通路有关。并且与上述核心靶标存在一定的联系。有研究表明PI3K/Akt 信号通路广泛参与调控细胞增殖、凋亡以及细胞周期等生理病理活动，该通路的失调与黑色素瘤的发生发展密切相关[16]。VEGFA 是一种具有高度特异性，并可促进血管生成的因子，通过与血管内皮细胞上的受体结合发挥作用[17]，抑制VEGF 表达能够减少新生血管的生成，从而抑制细胞增殖与侵袭能力[18]。有文献报道，VEGFA/VEGFR1 信号通路可作为预防黑色素瘤侵袭和转移的治疗靶点[19]。

分子对接结果表明，雷公藤甲素与Akt1、PTGS2、VEGFA 这3 个靶蛋白有较强的结合活性，借助氢键等分子间作用力产生较稳定构象。体外细胞毒性实验和Real-time PCR 实验证明了雷公藤甲素呈剂量相关性降低B16-F1 细胞中血管内皮生长因子VEGFA 和Akt1 的表达，抑制B16-F1 细胞增殖，发挥抗黑色素瘤作用。

综上所述，本文通过网络药理学揭示了雷公藤治疗黑色素瘤的潜在机制，证明了雷公藤多靶点、多通路治疗黑色素瘤，为雷公藤治疗黑色素瘤后续实验研究和临床研究提供理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突