一株内切葡聚糖酶产生菌株的分离鉴定及其产酶条件优化

赵思卡，许倍滔，冯喆，王力，张建国，李晓华*

（1 中南民族大学 a.生命科学学院；b.微生物资源与利用湖北省工程技术研究中心，武汉 430074；2 江苏神力生态农业科技有限公司，江苏 宜兴 214211）

纤维素酶是作用于纤维素中β-1，4-葡萄糖苷键的一组酶［1］，能够使纤维素变为葡萄糖和纤维二糖［2-3］，根据酶功能不同主要分为3 种：外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶［4］，纤维素酶在各行业应用广泛，在全球市场占据了酶产业份额的15%［5］.目前筛选到具有产纤维素酶能力的真菌主要来自木霉属（Trichoderma）、青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）和脉孢菌属（Neurospora）等；细菌主要来自芽胞杆菌属（Bacillus）、高温单胞菌属（Thermomonospora）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）等；放线菌主要有链霉菌属（Streptomyces）、小单胞菌属（Micromonospora）、分枝杆菌属（Mycobacterium）等［6］.秸秆主要成分为木质纤维素［7］，具有致密结构，在自然条件下难以被动物体降解和吸收［8］，纤维素酶在秸秆饲料中的应用可以起到增加饲料适口性和动物体吸收率等作用［9］.

本研究从健康的牛胃秸秆发酵物中分离内切葡聚糖酶产生菌株，并通过菌落特征、生理生化性质、16S rDNA 序列对比分析对菌株进行鉴定，进一步对菌株产酶条件进行研究，为内切葡聚糖酶在秸秆饲料中应用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验样品采自于湖南省长沙县养殖场健康牛胃中的秸秆发酵物.

1.2 培养基

（1）基础发酵培养基：葡萄糖5.0 g·L-1，酵母浸粉10.0 g·L-1，pH值自然.

（2）牛肉膏蛋白胨培养基：NaCl 5.0 g·L-1，蛋白胨10.0 g·L-1，牛肉膏3.0 g·L-1，琼脂18.0 g·L-1，pH值7.0.

（3）CMC-Na培养基：羧甲基纤维素钠10.0 g·L-1，酵母浸粉0.5 g·L-1，KH2PO41.5 g·L-1，蛋白胨0.5 g·L-1，MgSO40.3 g·L-1，NaCl 5.0 g·L-1，琼脂15.0 g·L-1，pH 值自然.

1.3 实验方法

1.3.1 产内切葡聚糖酶菌株的筛选

将牛胃秸秆发酵物在CMC-Na 液体培养基中37 ℃，180 r·min-1，富集培养24 h，取富集培养液1 mL，稀释涂布于CMC-Na固体培养基中，37 ℃培养24 h，多次分离纯化挑取单菌落.用牛津杯法［10-11］测定降解圈大小，实验设置3次重复.

1.3.2 菌株特征、生理生化特性及16S rDNA 序列的扩增分析

将筛选得到的菌株划线接种后，37 ℃培养12 h，革兰氏染色［12］，镜检观察.根据《常见细菌鉴定手册》对菌株进行生理生化鉴定［13］.提取菌株基因组DNA，使用16S rDNA 通用引物［14］扩增.PCR 产物由武汉擎科生物公司测序，利用BLAST 对16S rDNA序列比对分析，使用MEGA7.0构建系统进化树.

1.3.3 菌株产酶条件单因素优化

以培养时间、pH值、温度、碳源、氮源、无机盐作为影响因素，依次改变其中一个因素，研究各因子对SCUEC7菌株产内切葡聚糖酶的影响.

以1%接种量将SCUEC7 菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，37 °C，180 r·min-1培养48 h，每隔4 h测定一次菌体量和酶活性；分别将pH值设置为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，37 °C、180 r·min-1培养12 h 测定菌体量和酶活性；分别将培养温度设置为25、30、37、42、50、55 °C，180 r·min-1培养12 h，每个处理设置3 次重复，测定菌体量和酶活性.

以发酵培养基为基础，分别将唯一碳源设置为浓度分别为10 g·L-1的蔗糖、麦芽糖、果糖、淀粉、魔芋粉；唯一氮源设置为浓度分别为10 g·L-1的胰蛋白胨、牛肉膏、酪蛋白、尿素、硫酸铵；分别向培养基中添加浓度为1 g·L-1的K+、Cu2+、Na+、Mn2+、Mg2+，37 °C、180 r·min-1培养12 h，每个处理设置3 次重复，测定菌体量和酶活性.

按国际单位规定：在37 °C、pH 值7.0条件下，每分钟催化CMC-Na水解产生1 μg葡萄糖所需要的酶量定义为1个内切葡聚糖酶酶活性单位（1 U）.

1.3.4 菌株产酶条件响应面法优化

在单因素实验的基础上，采用Box-Behnken 响应面设计，分析各因素的交互作用，构建二次响应面回归模型，计算方差，得出最佳酶活性条件并验证.响应面试验各因素与水平如表1所示.

表1 响应面试验因素与水平Tab.1 Analytical factors and levels for response surface methodology

2 结果与讨论

2.1 产内切葡聚糖酶菌株筛选

将牛胃中秸秆发酵物在CMC-Na 液体培养基中富集培养，用生理盐水进行梯度稀释，涂布于CMCNa 固体培养基上，利用牛津杯法测定，结果如表2所示，11株菌株中纤维素降解圈在11.38～22.83 mm之间，G2 菌株直径最小，为11.38 mm，G7 菌株直径最大，为22.83 mm，将G7菌株命名为SCUEC7菌株.

表2 11株菌株降解圈大小Tab.2 Size of CMC-Na degradation circle of 11 strains

2.2 内切葡聚糖酶产生菌SCUEC7菌株的鉴定

将SCUEC7菌株接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，菌落扁平，呈圆形，边缘不规则，无光泽，呈现不透明黄白色，易挑起，无色素.SCUEC7 菌株生理生化特性测定结果：革兰氏染色试验、酪素利用试验、甲基红试验、伏-普试验、柠檬酸盐利用试验、淀粉利用试验、丙酸盐利用试验和硝酸盐还原试验结果呈阳性，硫化氢试验、枸橼酸盐利用试验和吲哚试验结果呈阴性.

以SCUEC7 菌株基因组DNA 为模板，PCR 法扩增菌株的16S rDNA 序列，利用BLAST 进行同源性序列比对，使用MEGA7.0 软件N-J 法构建系统进化树，结果如图1 所示，SCUEC7 菌株与Bacillussubtilisstrain ATCC 6015 相似度达到99%，结合SCUEC7 菌株形态特征、生理生化特性，初步鉴定SCUEC7菌株为枯草芽胞杆菌.

图1 基于16S rDNA 的SCUEC7菌株系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of SCUEC7 strain based on 16S rDNA

2.3 单因素实验优化产酶条件

2.3.1 培养时间

以1%接种量将SCUEC7 菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，结果表明（图2），培养时间在0～12 h范围内，菌株生长量和酶活性随时间的增加而增加；培养时间在12～48 h 范围内，菌株生长量和酶活性随时间的增加而下降.

图2 培养时间对SCUEC7菌株生长和产酶活性的影响Fig.2 Effects of culture time on the growth and enzyme production of SCUEC7 strain

2.3.2 pH值

以1%接种量将SCUEC7 菌株接种到不同初始pH 值的牛肉膏蛋白胨培养基中，培养12 h 后，pH 值在2.0～6.0 范围内，菌株的生长量和内切葡聚糖酶活性随pH 值的增加而增加（图3）；pH 值在6.0～11.0范围内，菌株生长量和酶活性随pH值的增加而逐渐降低.pH 值为6.0 时，SCUEC7 菌株产酶活性显著高于其他实验组（P＜0.05）.结果表明，pH 值为6.0 时，枯草芽胞杆菌SCUEC7 菌株生长量和酶活性较高.

图3 pH值对SCUEC7菌株生长和产酶活性的影响Fig.3 Effects of pH value on the growth and enzyme production of SCUEC7 strain

2.3.3 温度

培养温度在25～37 °C 范围内，菌株生长量和酶活性随培养温度的升高而增加（图4）；培养温度在37～55 °C 范围内，菌株生长量和酶活性随温度的升高而下降.温度为37 °C 时，SCUEC7 菌株产酶活性显著高于其他实验组（P＜0.05）.因此，培养温度为37 °C 时，枯草芽胞杆菌SCUEC7菌株生长量和酶活性较高.

图4 培养温度对SCUEC7菌株生长和产酶活性的影响Fig.4 Effects of culture temperature on the growth and enzyme production of SCUEC7 strain

2.3.4 碳源

当以麦芽糖作为碳源时（图5），枯草芽胞杆菌SCUEC7 菌株的内切葡聚糖酶活性较高，除与葡萄糖、果糖实验组差异不显著外，显著高于其他三个实验组（P＜0.05）.结果表明，麦芽糖为碳源时，枯草芽胞杆菌SCUEC7菌株的内切葡聚糖酶活性较高.

图5 不同碳源对SCUEC7菌株生长和产酶活性的影响Fig.5 Effects of different carbon sources on the growth and enzyme production of SCUEC7 strain

将培养基中的麦芽糖浓度分别设为5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 g·L-1的梯度，培养12 h 后发现（图6），麦芽糖浓度在5.0～20.0 g·L-1范围内，酶活性从203.8 U·mL-1增加到242.4 U·mL-1，麦芽糖浓度在20.0～30.0 g·L-1范围内，酶活性从242.4 U·mL-1下降 到198.0 U·mL-1.麦芽糖浓度为20.0 g·L-1时，SCUEC7 菌株产酶活性显著高于其他实验组（P＜0.05）.所以麦芽糖浓度为20.0 g·L-1时，枯草芽胞杆菌SCUEC7菌株的内切葡聚糖酶活性较高.

图6 不同浓度麦芽糖对SCUEC7菌株产酶活性的影响Fig.6 Effects of different concentration maltose on enzyme production of SCUEC7 strain

2.3.5 氮源

当胰蛋白胨作为唯一氮源时，SCUEC7 菌株的内切葡聚糖酶活性显著高于其他五个实验组（P＜0.05）.结果表明：胰蛋白胨为氮源时，枯草芽胞杆菌SCUEC7菌株的内切葡聚糖酶活性较高（图7）.

图7 不同氮源对SCUEC7菌株产酶活性的影响Fig.7 Effects of different nitrogen sources on enzyme production of SCUEC7 strain

将胰蛋白胨浓度分别设置成5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 g·L-1的浓度梯度，培养12 h 后，测定内切葡聚糖酶活性，结果如图8所示：胰蛋白胨的浓度在5.0～15.0 g·L-1范围内，酶活性由198.0 U·mL-1增加到222.0 U·mL-1，胰蛋白胨的浓度在15.0～30.0 g·L-1范围内，酶活性由222.0 U·mL-1下降到185.1 U·mL-1.胰蛋白胨浓度为15.0 g·L-1时，SCUEC7 菌株产酶活性显著高于其他实验组（P＜0.05）.结果表明，胰蛋白胨浓度为15.0 g·L-1时，枯草芽胞杆菌SCUEC7菌株的内切葡聚糖酶活性较高.

图8 不同浓度胰蛋白胨对SCUEC7菌株产酶活性的影响Fig.8 Effects of different concentration tryptone on enzyme production of SCUEC7 strain

2.3.6 金属离子

以1%接种量将SCUEC7 菌株分别接种到添加1.0 g·L-1的Na+、K+、Mn2+、Cu2+和Mg2+离子的基础发酵培养基中，培养12.0 h后（图9），添加Mn2+的实验组，SCUEC7 菌株的内切葡聚糖酶活性显著高于其他四个实验组（P＜0.05）.因此，添加Mn2+，枯草芽胞杆菌SCUEC7菌株的内切葡聚糖酶活性较高.

图9 不同金属离子对SCUEC7菌株产酶活性的影响Fig.9 Effects of different metal ions on the growth of SCUEC7 strain

将Mn2+浓度分别设置成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g·L-1的梯度，培养12.0 h 后，测定内切葡聚糖酶活性，结果如图10所示，Mn2+浓度在0.5～1.5 g·L-1范围内，酶活性由311.6 U·mL-1增长到354.3 U·mL-1，Mn2+浓度在1.5-3.0 g·L-1范围内，酶活性由354.3 U·mL-1下降到310.6 U·mL-1.Mn2+浓度为1.5 g·L-1时，SCUEC7菌株产酶活性显著高于其他实验组（P＜0.05）.

图10 不同浓度Mn2+对SCUEC7菌株产酶活性的影响Fig.10 Effects of different concentration Mn2+ on the growth of SCUEC7 strain

2.4 响应面试验优化结果

2.4.1 响应面设计与结果

选取培养时间、pH 值、麦芽糖含量3 个独立变量为考察因素，设计响应面试验，测定每组实验菌株酶活性，作为响应面法分析的依据，表3为响应面试验设计及结果.

表3 响应面各因素水平与产酶活性Tab.3 Factor level of response surface methodology and enzyme activity

2.4.2 响应曲面模型构建及回归方程结果显著性分析

使用Design-Expert 10 软件分析表4 实验数据，建立多元回归模型.拟合培养时间（A）、pH 值（B）、麦芽糖含量（C）之间的二次多项回归方程如下：酶活Y=408.78-3.38A-3.22B-1.67C-2.40AB-15.97AC+0.042BC-22.73A2-23.89B2-10.11C2.

表4 回归模型方差分析Tab.4 Regression model and analysis of variance

如表4 所示，模型的F=11.7，模型P=0.0019＜0.01，表明模型极为显著.R2=0.9377，表明该方程与对应的响应值吻合程度达93.77%.由F检验可知影响菌株SCUEC7 产酶活性的主次因素为培养时间＞pH 值＞麦芽糖含量.通过Design-Expert 10软件计算得出：当预测的响应值最大时，3 个因素所对应的最佳值是11.9 h，初始pH 值5.9，麦芽糖含量19.8 g·L-1.在此条件下所预测的最大酶活为 409.0 U·mL-1.

2.4.3 响应曲面交互作用及结果分析

培养时间、pH、麦芽糖含量3 个因素对SCUEC7菌株产酶活性影响的响应面图和等高线图见图11.由图可知，pH 值、培养时间之间存在较弱的交互作用；pH值、麦芽糖浓度之间和培养时间、麦芽糖浓度之间存在很强的交互作用.

图11 3因素对菌株产酶活性的交互影响Fig.11 The interaction effect of 3 factors on enzyme-producing activity of the strain

2.4.4 模型检验试验结果

将SCUEC7菌株最佳产酶活条件调整为培养时间11.9 h，初始pH 值6.0，麦芽糖含量19.8 g·L-1，此条件下进行3 组平行实验，所得平均酶活力为409.2 U·mL-1，与预测值409.0 U·mL-1差距不大，表明该结果符合客观实际.所以采用响应面法优化SCUEC7产内切葡聚糖酶条件可行.

3 结语

本研究从湖南省长沙县养殖场健康牛胃秸秆发酵物中分离得到枯草芽胞杆菌（Bacillussubtilis）SCUEC7 菌株，通过响应面分析，预测最优产酶条件下培养时间为11.9 h，初始pH 值为5.9，麦芽糖含量为19.8 g·L-1.

在动物饲料加工过程中，内切葡聚糖酶可高效降解秸秆饲料中的纤维素［15］，增加动物体营养物质利用率［16-18］.陈龙等研究Bacillusvelezensis157 发现，以碱处理玉米秸秆和豆粕的质量比为1.0∶1.0，底物与水分质量比为1.0∶0.5，于37 °C 培养温度下发酵24 h后，其内切葡聚糖酶活性为56.83 U·mL-1［19］；何楠等从玉米秸秆中分离出一株枯草芽胞杆菌BS-DX4，在最适生长温度 40 °C，最适pH 值7.0 条件下，该菌株胞外分泌液内切葡聚糖酶最高活性为358.3 U·mL-1［20］，其最高酶活低于SCUEC7 菌株，最适pH 值与最适温度高于SCUEC7 菌株；马振刚等从自然界分离出一株蜡样芽胞杆菌Bacilluscereusstrain CQNUX 3-1，在70 °C、pH 值8.0 条件下该菌株胞外分泌液内切葡聚糖酶最高活性为107.7 U·mL-1［21］，最高酶活低于SCUEC7 菌株，最适pH 值与最适温度高于SCUEC7.虽然研究者已从芽胞杆菌中分离出多株产内切葡聚糖酶菌株，但远不能满足工业生产对产酶菌株需求和酶性质的要求，产内切葡聚糖酶菌种资源筛选备受关注.本研究为内切葡聚糖酶的工业化生产提供了微生物资源.