利用指纹图谱和网络药理学预测牵牛子抗炎Q-marker

李娟，彭洪兵，向玉林，刘雪年，孙媛，詹志来

（1 湖北中医药大学 药学院，武汉 430065；2 中国中医科学院 中药资源中心/道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100007）

牵牛子，又名黑丑、白丑、二丑等，为旋花科植物裂叶牵牛Pharbitisnil（L.）Choisy或圆叶牵牛Pharbitis purpurea（L.）Voigt 的干燥成熟种子，始载于《名医别录》.其味苦性寒，有毒，具有泻水通便、消痰涤饮、杀虫攻积的功效［1］.牵牛子主要含有酚酸类、树脂苷类、木脂素类、萜类、脂肪油类等化学成分.据报道，树脂苷类是牵牛子泻下作用的主要活性成分，但是该类成分结构复杂多样，研究起来较为困难.目前中国药典对其质量控制的方法主要为醇浸出物测定，该方法并不能较好地控制牵牛子的质量.

中药质量标志物是刘昌孝院士于2016 年针对中药质量标准与质量控制提出的概念［2-3］.同时，网络药理学能从系统层面揭示中药对机体调控的网络作用机制，反映出有效成分与靶点蛋白之间的作用关系，具有系统性与整体性的特点［4］.由于目前网络药理学缺乏规范的技术引领，分析结果存在诸多问题，数据采集不规范，预测结果差异大，缺乏验证等等，因而本文根据《网络药理学评价方法指南》按照规范操作预测牵牛子质量标志物［5］.本研究通过牵牛子指纹图谱、主要成分测定和网络药理学相结合的方法分析预测牵牛子的抗炎Q-marker，并通过分子对接和抗炎活性验证，为全面控制牵牛子的质量，进一步研究牵牛子的作用机制提供参考.

1 仪器与材料

高效液相色谱仪（1260 Infinity II，美国安捷伦）；色谱柱（Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 2.1 ×50 mm，1.8-Micron）；电子分析天平（BP211D，德国Satorius）；超声清洗器（KUDOS SK250H，上海科导）.

新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C（成都瑞芬）；绿原酸（中国食品药品检定研究所）；异槲皮苷（上海麦克林）；咖啡酸（成都德思特）.超纯水；甲醇（上海麦克林，色谱纯）；其余试剂为分析纯.DMEM 高糖培养基（北京索莱宝）；胎牛血清（FBS，四季青）；二甲基亚砜（DMSO，国药集团）、四甲基偶氮唑蓝（MTT，上海麦克林）；一氧化氮检测试剂盒（碧云天）.小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 由华中科技大学同济医学院免疫学教研室馈赠.牵牛子共16批收集于各地药材市场或企业，药材来源信息见表1，经湖北中医药大学陈科力教授鉴定为旋花科植物裂叶牵牛Pharbitisnil（L.）Choisy 或圆叶牵牛Pharbitispurpurea（L.）Voigt的干燥成熟种子.

表1 16批牵牛子药材样品来源信息Tab.1 Source information of 16 batches of Pharbitidis Semen medicinal materials

2 实验方法

2.1 色谱条件

流动相：0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B）；梯度洗脱0～2 min，10%～30% B；2～10 min，30%～65% B；10～14 min，65%～80% B；14～15 min，80%～100%B；15～17 min，100%～10% B.柱 温25 ℃；流 速0.25 mL·min-1；检测波长296 nm；进样量1 μL.

2.2 样品溶液的制备

称取不同批次牵牛子Q1～Q16 样品粉末（过四号筛）1.0092、1.0096、1.0020、1.0065、1.0073、1.0096、1.0076、1.0023、1.0074、1.0041、1.0071、1.0017、1.0061、1.0054、1.0064、1.0011 g，置于100 mL锥形瓶中，加入25 mL 的70%甲醇，称重，超声处理1 h（40 kHz，240 W），自然放置冷却后称定重量，用70%甲醇补足损失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得.

2.3 方法学考察

称取牵牛子样品（Q2），按照2.2 方法制备样品，按照2.1的色谱条件进样.

精密度试验：连续进样6次，计算得到各共有峰相对保留时间和相对峰面的RSD.

稳定性试验：分别在0、2、4、8、12、24 h 进样，计算得到各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD.

重复性试验：平行制备6份样品进样，计算得到各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD.

加样回收实验：牵牛子（Q2）6份样品，分别加入7种标准品，结果代入回归方程计算出7种化合物的回收率和RSD.

2.4 指纹图谱的建立

取牵牛子供试品一共16 批，按照2.2 方法制备样品溶液，按照2.1 的色谱条件进行进样检测，并采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”进行相似度评价.

分别以对照图谱S1 为参照，对16 批牵牛子黑白丑供试品进行相似度评价.

2.5 主成分分析

利用SPSS 21.0软件进行主成分分析.

2.6 偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）

以VIP＞1 为筛选标准，筛选出影响牵牛子药材成分差异的标志性成分.

2.7 多成分含量测定

2.7.1 线性关系考察试验

取新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、异槲皮苷、异绿原酸C 对照品1.10、2.02、2.66、1.52、1.21 mg，用甲醇溶解，配成混合对照品母液，将混合对照品母液逐级稀释成5 个浓度，按照2.1 项下的色谱条件进样，记录色谱峰信息，绘制标准曲线（横坐标为各对照品的浓度，纵坐标为峰面积值）.

2.7.2 含量测定

按照2.2 方法制备16 批牵牛子供试品溶液，按照2.1 色谱条件进样，记录色谱图信息，将新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、异槲皮苷和异绿原酸C 的峰面积数据代入上述线性方程，计算出药材中的成分含量.

2.8 网络药理学分析

2.8.1 牵牛子化合物的靶点预测［6］

检索Swiss Target Prediction 数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、中药系统药理数据库（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中咖啡酸、新绿原酸、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、异槲皮苷7 个化合物，预测化合物作用的靶点；以probability＞0.1 为条件，筛选出靶点信息.搜索Uniprot 数据库（http：//www.uniprot.org/），将预测出的靶点蛋白名称输入后，找到对应的基因名.然后整理各数据库筛选出的靶点蛋白，将重复靶点除去.

2.8.2 蛋白相互作用（PPI）网络分析

利用STRING 11.0 软件（https：//string-db.org/cgi/input.pl），输入 82 个选中的靶点，选择人（homo sapiens），点击确认，最高置信度选择＞0.9，隐藏网络中的单一节点，其他参数设置不变，得到 PPI 网络图.再利用Cytoscape 3.7.2 软件选取药物作用靶点，共得到 32个相关靶点.

2.8.3 功能富集分析与通路分析

利用David 6.8 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），输入选中的32个靶点蛋白，物种选择为人，选择P值＜0.05、FDR＜0.05，进行 GO 功能和KEGG 通路富集分析.

2.8.4 构建成分-靶点-通路网络［7］

将筛选得到的7 个成分、32 个靶点和6 条通路数据整理完成后导入Cytoscape 3.7.2 软件，构建“成分-靶点-通路”网络图.

2.9 分子对接验证分析与可视化

根据网络药理学成分与靶点之间的连接度选择异绿原酸C（连接度最大）作为分子对接配体展示，核心靶点MMP1、MMP2、MMP13、AKR1B1、AKR1B10 作为受体，在Pubchem 数据库下载配体的3D结构图，在RSCB PDB 数据库下载受体的蛋白3D结构图.利用AutoDockTools1.5.6软件对受体和配体进行去水、加氢等处理，将配体与受体进行分子对接计算，导出配体与受体之间的结合能.

2.10 牵牛子标志物的抗炎活性验证

2.1 0.1 细胞培养

RAW264.7 细胞于37 ℃、5% CO2环境下，在含有10% FBS 和 1%双抗的高糖 DMEM 培养液中培养.当细胞生长至80%时，进行传代并用于后续实验.

2.1 0.2 MTT 法检测 RAW264.7 细胞存活率

取对数期 RAW264.7 细胞，以 1 × 104个/ 孔密度接种于96孔板中，培养24 h 后，吸出培养液，加入用DMEM 培养液配制的各浓度药物 100 μL，使牵牛子各单体化合物的浓度分别为50、100、200、400 μM，牵牛子提取物的浓度为50、25、12.5、6.25 μg/mL，每个浓度设置 6 个复孔.24 h 后弃去含药培养液，每孔加入含 5 mg/mL MTT 的高糖 DMEM 培养液 100 μL 并继续培养 4 h，吸出培养液，每孔加入100 μL DMSO，震荡10 min 后用酶标仪于 490 nm 波长测定各孔的吸光度（OD）值.

2.1 0.3 Griess法检测RAW264.7细胞NO分泌量

将RAW264.7 细胞以 2 × 105个/ 孔的密度接种于24 孔板中，培养24 h 后弃去旧培养液，分别加入用DMEM 培养液配制的各浓度药物（根据 MTT 细胞活力实验选择浓度），并设置空白组与模型组（LPS 组），每组3 个复孔.药物作用于细胞 2 h 后，除空白组外，其余各组加入LPS使其终质量浓度为 0.5 μg/mL.继续培养24 h 后，收集细胞培养上清，使用NO 检测试剂盒按照 Griess 法进行检测.

3 结果与分析

3.1 方法学考察

精密度试验：结果共有峰相对保留时间RSD 为0.05%～0.43%、相对峰面积RSD 为0.61%～2.72%，表明仪器精密度良好.

稳定性试验：结果共有峰相对保留时间RSD 为0.01%～0.50%、相对峰面积RSD 为0.21%～4.01%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好.

重复性试验：结果共有峰相对保留时间RSD 为0.06%～0.90%、相对峰面积RSD 为0.51%～3.90%，表明该方法重复性良好.

加样回收实验：结果代入回归方程计算出7 种化合物的回收率为104.96%、96.85%、101.67%、97.25%、102.60%、97.24%、98.15%.RSD 分别为2.62%、2.47%、2.67%、2.80%、2.87%、2.97%、2.74%.表明回收效果好.

3.2 指纹图谱的建立

3.2.1 指纹图谱分析

16 批牵牛子药材指纹图谱和混合对照品色谱图分别见图1和图2.

图1 16批牵牛子药材指纹图谱Fig.1 Fingerprints of 16 batches of Pharbitidis Semen

图2 混合对照品色谱图Fig.2 Chromatogram of mixed reference substance

3.2.2 相似度评价

结果显示部分样品相似度小于0.6（表2）.由此可见，牵牛子样品虽然来源复杂，但7个共有成分在16批样品中均稳定存在.

表2 16批牵牛子供试品与对照图谱的相似度Tab.2 Similarity of 16 batches of Pharbitidis Semen test substance and control chromatogram

3.3 主成分分析

前3 个主成分（2、5、3 号峰）包含了7 个共有成分的91.177%的信息（表3）.说明这3 个成分能够概括共有峰总数据的绝大部分信息.碎石图见图3.

图3 牵牛子主成分分析碎石图Fig.3 Pharbitidis Semen principal component analysis gravel diagram

表3 牵牛子供试品主成分特征值及累计方差贡献率Tab.3 Principal component eigenvalues and cumulative variance contribution rate of Pharbitidis Semen test products

3.4 偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）

一共标记出3个贡献较大的成分，依次为2、5、3号色谱峰，分别为化合物绿原酸、异绿原酸A和咖啡酸，与主成分分析结果一致（图4）.

图4 牵牛子样品PLS-DA 模型中 7 个色谱峰的 VIPFig.4 VIP of seven chromatographic peaks in the PLS-DA model of the Pharbitidis Semen sample

3.5 多成分含量测定

线性关系考察试验结果表明，5 种成分在一定范围内线性关系良好.标准曲线结果见表4.

表4 牵牛子5种成分的线性关系Tab.4 Linear relationship of the five components of Pharbitidis Semen

药材中的5种成分含量测定结果见表5.

表5 牵牛子中5种成分含量测定结果（n=3）Tab.5 Determination results of five components in Pharbitidis Semen（n=3）

3.6 网络药理学分析

3.6.1 牵牛子化合物的靶点预测

最终得到与7个化合物相关的82个靶点蛋白.

3.6.2 蛋白相互作用（PPI）网络分析

PPI 网络图（图5）和 32个相关靶点（图6）.

图5 PPI网络图Fig.5 PPI network diagram

图6 牵牛子“成分-靶点-通路”网络Fig.6 “Component-target-pathway” network of Pharbitidis Semen

3.6.3 功能富集分析与通路分析

GO分析结果提示BP显著富集在炎症反应的调节、细胞外基质拆卸、MAP 激酶活性的正调控、平滑肌细胞增殖的正向调控、胶原分解代谢过程、以及对糖皮质激素、脂多糖、缺氧的反应等过程，其中炎症反应的调节功能和调节平滑肌收缩的功能可能分别与牵牛子消痰涤饮、泻水通便的功效有关；MF主要富集在内肽酶活性、酶结合功能；CC 主要富集在质膜.具体信息见表6.富集到的6 条通路，为雌激素信号通路、癌症途径、TNF信号通路、膀胱癌、癌症的蛋白聚糖、血清素能突触，表明这6个通路可能是32 个靶点干预疾病的主要途径（表7）.其中TNF信号通路和膀胱癌信号通路可能分别与牵牛子抗菌消炎、利尿的作用有关.牵牛子有刺激子宫的药理作用［8］，对离体兔肠及离体大鼠子宫有兴奋作用，这可能与雌激素信号通路有关.

表6 基因生物学过程Tab.6 Gene biology process

表7 主要作用靶点的通路富集分析Tab.7 Pathway enrichment analysis of main targets

3.6.4 构建成分-靶点-通路网络

以成分、靶点、通路之间的连接度为参考（图6），发现异绿原酸B 和异绿原酸C 的连接度较高，可能是发挥作用的主要成分；MMP1、MMP2、MMP13、AKR1B1、AKR1B10相关的成分通路相对较多，这5个靶点蛋白可能是牵牛子发挥作用的关键靶点；6 条信号通路的连接度相差不大，都有可能是牵牛子的潜在Q-marker关键信号通路.

3.7 分子对接验证分析与可视化

异绿原酸C与MMP1、MMP2、MMP13、AKR1B1、AKR1B10 的结合能依次为-8.6、-5.5、-9.8、-9.6、-8.5 kcal/mol，结合能越小，配体与受体之间越容易结合.5个配体与化合物结合能均较小，表明化合物与关键靶点之间有较强的结合活性，并运用Pymol3.2软件进行可视化处理，结果见图7.

图7 靶点与异绿原酸C分子对接图Fig.7 The docking diagram of the target and isochlorogenic acid C molecule

抗炎Q-Marker 异绿原酸C 与MMP2、MMP13 的结合能分别为-9.8 kcal/mol 和-9.6 kcal/mol，远低于-4.0 kcal/mol［9］，这说明配体有较强的生物活性.

3.8 牵牛子标志物的抗炎活性验证

3.8.1 MTT 法检测 RAW264.7 细胞存活率

结果表明，25 μg/mL 以下的牵牛子提取物和7个单体成分在各浓度下细胞存活率均大于85%，表明提取物和7 个单体成分无明显的细胞毒副作用（图8）.

图8 牵牛子提取物和各单体对RAW264.7细胞存活率的影响Fig.8 Effects of Pharbitidis Semen extract and each monomer on the viability of RAW264.7 cells

3.8.2 Griess法检测RAW264.7细胞NO分泌量

结果表明，牵牛子提取物（25 μg/mL）可显著抑制LPS 诱导的RAW264.7 细胞产生NO，抑制率达到269%（图9）.浓度为100 μM 时，牵牛子各单体均可抑制LPS 诱导的RAW264.7 细胞产生NO，其中咖啡酸、异绿原酸B的抑制效果较好，均大于50%.

图9 牵牛子提取物和各单体对LPS诱导的RAW264.7细胞产生NO的影响Fig.9 Effects of Pharbitidis Semen extract and each monomer on NO production in LPS-induced RAW264.7 cells

4 讨论

本研究通过UPLC 建立了牵牛子的指纹图谱，指认了牵牛子中7 个共有成分，通过主成分和偏最小二乘法判别分析等找出3 个主要成分绿原酸、咖啡酸和异绿原酸A.绿原酸具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、降血脂、降血糖和免疫调节等多方面的生物活性［10］，有利尿补肾的功效［11］，能显著增加肠胃蠕动，促进胃液分泌.研究发现绿原酸是通过调控丝裂原活化蛋白激酶/ ERK/c-Jun 氨基末端激酶信号通路来降低组织的炎症反应［12］.咖啡酸具有抗氧化、抗炎、免疫调节、抗菌等多种药理作用［13］，可以抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌、单核细胞增生利斯特菌的生长，具有一定的毒性，可能与牵牛子杀虫功效有关.咖啡酸等小分子酚酸类成分的自氧化过程中会产生含1，4-苯并二噁烷结构的化合物，此类化合物具有很好的抗炎活性［12］.绿原酸和咖啡酸中的儿茶酚基团可以清除细胞内活性氧，通过抑制人肠上皮细胞中PKDNF-κB 信号来抑制H2O2诱导的IL-8 的产生，从而抑制严重的细胞损伤和炎症性肠道疾病.新绿原酸为绿原酸的同分异构体，具有抗炎、抗氧化、增强免疫等作用.杨海星［14］研究发现，新绿原酸对由LPS 诱导的RAW264.7 细胞具有明显抗炎作用，其机制可能与下调P-NF-κbp65 有关.异绿原酸A、B、C 是金银花中有机酸类天然活性成分，在其他植物中也广泛存在［15-18］.异槲皮苷为黄酮醇苷类化合物，具有抗炎、抗病毒、降血压等多种药理活性，能在抗Cd2+诱导的肾脏和肝脏毒性中发挥重要作用.异槲皮苷能够抑制血管紧张素转化酶，起到抗高血压的功效，并且具有利尿和保钾的功能［16］.综上，7 种化合物具有抗菌消炎、利尿通便等功效，与牵牛子的传统功效相似，可作为牵牛子的潜在抗炎Q-marker.

结合牵牛子的功效，运用网络药理学分析筛选出与7个化学成分相关的32个靶点、6条通路.分子对接分析验证其中异绿原酸C 具有很好的生物活性，由于7 个化合物均做分子对接验证，数据繁多，而7 个化合物结构相似，与受体的结合能也应该相似，本文未一一验证.抗炎活性实验验证牵牛子提取物以及7种化合物均可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞产生NO，具有很好的抗炎效果，可能是通过上述6 条通路相互作用于32 个蛋白靶点起作用，进一步说明这7种化合物可作为牵牛子的抗炎Q-marker.

Q-marker 的“五原则”的特点包含特有性、有效性、可测性、传递与溯源性、和处方配伍，反映了中药的安全性和有效性，有利于中药质量溯源体系建设和全程质量控制［17］.虽然文献报道牵牛子苷为牵牛子泻下和杀虫等的有效成分，但研究发现树脂糖苷类化合物牵牛子苷检测难度大，不具备可测性，并不适合作为Q-marker.同时由于样品本身来源复杂，指纹图谱分析发现调查的16批牵牛子样品相似度较低，指纹图谱也不太适合用于牵牛子的质量控制.但结合含量测定和网络药理学结果，本研究筛选出的7 个成分在牵牛子各批次样品中稳定存在，在生品和炮制品中均能检测出［18］，并具有相关的药理活性.因而，本研究筛选出的7个化合物虽不是牵牛子中的特有成分，但也满足化学性质与药理作用也与牵牛子的传统药性和功效基本一致的条件，且含量较高、稳定，检测识别方法简单快捷，具备有效性、可测性、可传递性等特点，适合作为牵牛子的抗炎Q-marker.