结核分枝杆菌H37Rα感染肺泡巨噬细胞外泌体提取及鉴定

马 荣,杨万忠,戈朝晖

外泌体是细胞间相互作用的关键介质之一,在疾病的发生、发展过程中扮演着重要角色[1-2],近年来,外泌体在生物医学领域中的研究热度不断上升。结核分枝杆菌是一种常见的致病菌,其感染可导致肺部炎症损害[3-4]。然而,目前对于结核分枝杆菌感染对肺泡巨噬细胞外泌体分泌的影响尚不清楚。因此,本研究旨在通过建立结核分枝杆菌H37Rα菌株刺激的RAW264.7细胞模型,探讨其感染对肺泡巨噬细胞外泌体的影响,并对外泌体的形态学特征进行分析鉴定。本研究将可能对外泌体在结核病发病机制中的作用提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 主要试剂与仪器:小鼠单核巨细胞(RAW264.7,中国科学院细胞库),结核分枝杆菌(H37Rα,上海唯问生物技术有限公司),蛋白质印迹法(WB)专用细胞裂解液(上海晶诺生物科技有限公司),TSG101 (武汉三鹰生物技术有限公司),CD63、CD81[赛默飞世尔科技(中国)有限公司],超滤管(Millipore,美国),T-25 培养瓶(Corning,中国),96、24 孔培养板(NEST,美国),透析袋(BLUEBIRD,美国),DEM-3 型自动洗板机(北京拓普分析仪器有限责任公司),酶标仪(BIO-RAD 680,美国),二氧化碳培养箱(SANYO,日本),HD-4 层析工作站(上海沪西仪器厂),胎牛血清、DMEM、HAT(Sigma,美国),PEG 4000(Merck,德国),HiTrap protein G、硝酸纤维素膜(Amersham,美国),蛋白Marker(Fermentas,美国),外泌体抽提试剂盒(翊圣生物,41201ES25),层析柱(Phamacia,美国),蛋白质电泳转移仪(Bio-Rad,美国),NanoDrop超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific,美国),透射式电子显微镜 HT-7700 (Hitachi,日本)。

1.2 实验方法

1.2.1 结核分枝杆菌培养:取新鲜鸡蛋18～20个,清洁外壳,在75%酒精中浸泡1 h,使用无菌镊子打开鸡蛋的一端,将蛋液全部倒入无菌三角烧瓶中,用无菌玻璃棒充分搅拌均匀。改良罗氏培养基制备方法为称量磷酸二氢钠1.2 g、硫酸镁0.12 g、天门冬素1.8 g、枸橼酸钠0.3 g、氯化钠5 g、纯甘油6 mL、辅酶A 400 U、三硫酸腺苷40 mg、蒸馏水300 mL,加热溶解,冷却后加入15 g新鲜马铃薯粉,逐渐加热至沸腾,不断搅拌,约20 min后(56 ℃)加入全蛋液500 mL、人血清20 mL以及10 g/L孔雀绿水溶液20 mL,玻璃棒搅拌均匀,按6 mL/管分装至15×16 mm玻璃试管中,置于血清凝固器中使培养基凝固成斜面(90 ℃,1 h),无菌试验合格后备用。结核分枝杆菌H37Rα菌株接种于改良罗氏培养基中,生长20 d后收集菌体。

1.2.2 单核巨噬细胞RAW264.7培养:RAW264.7完全培养90%RPMI1640+10% FBS+100U/mL青霉素+0.1 mg/mL链霉素将RAW264.7细胞复苏后,离心,弃去上清液,加入完全培养基重悬细胞,转移至10 cm培养皿中,在37 ℃的细胞培养箱中,定时观察并更换新鲜培养基,培养24～48 h。

1.2.3 结核分枝杆菌H37Rα菌株刺激肺泡巨噬细胞系RAW264.7的实验分组与设计:建立结核分枝杆菌(MTB)刺激的巨噬细胞模型。实验分为感染组与非感染组,以感染复数(MOI)为 10 的比例将感染组的巨噬细胞 RAW264.7 用H37Rα菌株进行感染刺激。分别配制含有10%胎牛血清(FBS)+1%双抗(青、链霉素)的DMEM细胞培养基与仅含10%胎牛血清(FBS)的DMEM细胞培养基。非感染组空白培养基刺激巨噬细胞,实验组以H37Rα刺激细胞。在37 ℃、50 mL/L CO2细胞培养箱中培养。24 h后收集H37Rα菌株感染的巨噬细胞模型。

1.2.4 外泌体抽提

1.2.4.1 外泌体抽提试剂盒:取10 mL细胞上清液,加入2.5 mL外泌体抽提试剂(41201-A),采用涡旋震荡混匀1 min,于4 ℃静置2 h;10 000 g、4 ℃离心60 min,弃上清液,收集沉淀(尽可能吸尽上清);取100 μL 1×PBS均匀吹打沉淀物,使其充分混匀,并转移到新的1.5 mL离心管中;12 000 g、4 ℃离心2 min,所得外泌体沉淀用100 μL 1×PBS 重悬。BCA法蛋白定量后调整蛋白浓度为0.5 mg/mL。

1.2.4.2 电镜检测:取10 μL新鲜外泌体溶液,以30 g/L磷钨酸染色5 min,染色后的外泌体滴于铜网膜上,于65 ℃烤干,在透射电镜下观察。

1.2.5 Western-blot检测:取50 μL外泌体,加入等体积的WB专用蛋白裂解液,加入上样缓冲液,将其加热至100 ℃并保持10 min使蛋白质变性,之后冷却至室温。配制浓度为12%分离胶和5%的浓缩胶,上样进行电泳,将蛋白质根据大小进行分离。通过Trans-blot turbo转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉在室温下封闭1.5 h,然后加入TGS101、CD63、CD81抗体,并在4 ℃孵育,过夜。将PVDF膜置于保鲜膜上,用TBST溶液洗涤PVDF膜3次,每次10 min。然后加入相应的二抗,室温下反应1.5 h。用TBST溶液再次洗涤PVDF膜3次,每次10 min。然后移入凝胶成像分析仪中,用化学光敏模式曝光显影。

2 结果

2.1 外泌体电镜及NTA检测:外泌体的电镜检测结果见图1(目次后)。透射电镜下提取的两组外泌体均呈圆形或类圆形,部分呈鹅卵石样,粒径20～140 nm,其具有典型的杯状形态和脂质双层结构。将分离后的外泌体按1∶100比例重悬到1 mL无菌水中,应用NTA分析记录外泌体的直径和大小分布。NTA检测显示感染组外泌体粒径峰值124 nm,非感染组外泌体粒径峰值133 nm。

2.2 Western-blot检测外泌体表面蛋白TGS101、CD63、CD81:蛋白免疫印迹验证提取外泌体的特征蛋白,Western-blot技术对感染组与非感染组的外泌体表面的标志性蛋白TGS101、CD63、CD81进行了检测。H37Rα感染组和非感染组的外泌体表面标志性蛋白检测结果均为阳性,见图2(目次后)。

3 讨论

外泌体是一种由活细胞分泌、直径为30～150 nm、由双层脂质膜构成的小囊泡[5]。它在机体内广泛分布,分布于外周血、腹水、大小便、唾液、脑脊液以及各类体液等[6-7]。外泌体所携带的各种蛋白质、脂肪、DNA和RNA等重要信息,不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用,更有望成为多种疾病的早期诊断标志物[8-9]。外泌体的提取与分离方法通常包括密度梯度离心、超速离心、体积排阻、免疫磁珠、聚合物沉淀以及试剂盒等方法[10-11]。超速离心法[12]是最早的外泌体分离技术,通过高速离心机将细胞上清液中的外泌体分离出来。该方法分离得到的外泌体纯度较高,但是产量较低,不适用于大规模研究;密度梯度离心法通过将细胞上清液置于不同密度的梯度介质中,利用外泌体在不同介质中的密度差异而逐渐沉淀,然后收集沉淀物中的外泌体,该方法分离得到的外泌体产量较高,但是纯度较低;免疫磁珠法[13]利用外泌体表面抗原与特异性抗体结合的原理,将外泌体与免疫磁珠特异性结合,并通过磁场将免疫磁珠与外泌体分离,该方法分离得到的外泌体纯度较高,但是需要特殊的设备和试剂;聚合物沉淀法利用某些聚合物的电荷吸附作用,将细胞上清液中的外泌体吸附并沉淀下来,然后收集沉淀中的外泌体,该方法分离得到的外泌体产量较高,但是纯度较低。选择合适的方法是进行外泌体相关研究的关键。本研究采用结核分枝杆菌H37Rα稳定减毒株进行研究。为确保实验的安全性和高效性,本研究特别选择了免疫磁珠法,其原理主要基于外泌体的生物学特性以及膜蛋白和外泌体特异性标记物的相互作用。试剂盒使用了免疫磁珠这一高亲和力材料,它具有特异性结合外泌体膜蛋白的能力,外泌体膜蛋白与试剂盒材料发生结合形成复合物,通过离心后复合物会沉降,从而与上清液分离。

本研究中感染组的外泌体均可观察到典型的杯状形态和双层膜结构,且外泌体的粒径大小分布图均为单一主峰,无明显的杂峰,说明提取的外泌体粒径分布均匀,质量稳定。此外,外泌体还有一些标志性的蛋白质组成,为其鉴定提供了更为充足的证据。通过Western-blot技术检测非感染组和感染组的外泌体的跨膜蛋白CD9和CD81,均为阳性,说明所提取的细胞外囊泡的表面标志蛋白符合外泌体的表征。

本研究采用建立结核分枝杆菌H37Rα菌株刺激的肺泡巨噬细胞模型,利用试剂盒法成功分离并提取出外泌体,并对外泌体的形态特征进行分析和鉴定。通过测定其生物特异性标志蛋白以及形态学分析,表明提取的外泌体含量和纯度均较高,为今后进一步深入研究巨噬细胞来源的外秘体在结核病中的免疫应答提供了重要依据,以确保今后有关试验的顺利开展。