基于正交设计探索高尿酸血症大鼠模型的最佳配伍

王 燕,杨宇轩,彭 玥,郭忠琴

随着经济的发展和人们生活水平的提高,高尿酸血症(HUA)的发病率也呈快速增长趋势,且与动脉粥样硬化、原发性高血压、冠心病和糖尿病等疾病的发生发展及死亡密切相关,已然成为危害人类健康的主要疾病之一。因此,构建高尿酸血症模型是疾病研究及高效安全的降尿酸药物研发的基础。

近年来,高果糖饮食已被证实与痛风发病呈正相关[1],长期的高果糖摄入正在影响着人类的健康[2-4]。对于年轻群体来说,由于现代食品技术的改进,添加糖[高果糖玉米糖浆(HFCS)]代替了传统的蔗糖糖浆,广泛应用于食品加工,已经成为乳制品、软饮料、面包和糕点等加工食品中的主要甜味剂[5]。含糖饮料、烘焙糕点以及高糖水果的大量摄入都是尿酸升高的潜在影响因素。已有研究表明,果糖是唯一能通过长期摄入使血清尿酸升高的糖类[6]。为了模拟人类因高糖饮食而引起的高尿酸血症,建立长期、稳定、肝肾损伤小的高尿酸血症动物模型,本研究以SD大鼠为研究对象,利用氧嗪酸钾竞争性地与大鼠体内尿酸酶结合,抑制尿酸分解的特性[7-9]联合果糖,根据三因素两水平的正交设计探索给药剂量与给药途径的最佳配伍。

1 资料与方法

1.1 一般资料:用到的试剂和仪器有果糖[(D-(-)-Fructose,美国SIGMA公司)];氧嗪酸钾(OAPS,美国SIGMA公司);尿酸、尿素氮、肌酐测定试剂盒[贝克曼库尔特(爱尔兰)股份有限公司];AU400全自动生化分析仪(Olympus)等。

1.2 实验动物:6周龄SPF级雄性SD大鼠20只,体重(180±20)g。动物实验方案通过宁夏医科大学实验动物中心审批,符合宁夏医科大学实验动物伦理委员会所制定的伦理学标准(动物许可证IACUC-NYLAC-2022-030)。

1.3 方法

1.3.1 动物模型建立:按照完全随机设计将20只大鼠分为4个实验组和1个空白对照组,共5组,再根据三因素两水平正交设计表按照相应实验安排将实验组分为4组[A1B1C1组采用5%果糖水+100 mg/(kg·d)OAPS灌胃;A1B2C2组采用5%果糖水+200 mg/(kg·d)OAPS腹腔注射;A2B1C2组采用10%果糖水+100 mg/(kg·d)OAPS腹腔注射;A2B2C1组采用10%果糖水+200 mg/(kg·d)OAPS灌胃],其中,灌胃组每日8:00给药,腹腔注射组每日8:00和18:00给药,连续给药8周。

1.3.2 样本的收集及血清生化指标测定:各组大鼠于实验开始前、实验开始后第2、4、6周进行眼眶静脉窦采血,第8周末进行心尖取血,取血前禁食并禁水12 h。血液静置2 h后以转速2 000 r/min离心15 min,取上层血清,于-80 ℃冰箱保存。将冷冻保存的血清常温解冻,使用全自动生化分析仪进行尿酸、尿素氮、肌酐水平的测定。心脏血收集结束后,取右叶肝脏、右侧肾脏制作HE染色切片,光学显微镜下观察。

2 结果

2.1 不同时间各组大鼠生长情况及血清学变化比较

2.1.1 不同时间各组大鼠体重比较:整个实验过程中各组大鼠活动正常、毛色正常、精神状态良好、体重增长均匀、未出现死亡,见表1。

表1 不同时间各组大鼠体重比较

2.1.2 不同时间各组大鼠饮水量比较:第0周为大鼠适应性喂养阶段,从实验第1周开始各实验组大鼠自由饮用果糖水,从实验第2周开始,除A1B2C2组第3周、第8周、A2B1C2组第7周,A2B2C1组第8周外,各组间饮水量比较差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 不同时间各组大鼠饮水量比较

2.1.3 不同时间各组大鼠尿酸水平比较:实验第8周时,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。观察各组尿酸变化趋势,仅有A1B1C1组大鼠尿酸出现明显升高趋势,其余各组大鼠尿酸水平变化比较差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

表3 不同时间各组大鼠尿酸水平比较

2.1.4 不同时间各组大鼠血清尿素氮水平比较:仅在实验第2周时,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。其余各时间点空白对照组与实验组比较差异无统计学意义(P>0.05),见表4。

表4 不同时间各组大鼠血清尿素氮水平比较

2.1.5 不同时间各组大鼠血清肌酐水平比较:空白对照组与各实验组大鼠血清肌酐水平均呈上升趋势,实验第8周时,各组大鼠血清肌酐比较差异有统计学意义(P<0.05);A1B1C1组、A2B2C1组与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),其余各实验组与空白对照组比较均无统计学意义。各实验组组间比较差异无统计学意义(P>0.05),见表5。

表5 不同时间各组大鼠血清肌酐水平比较

2.2 各组大鼠组织病理切片观察

2.2.1 肝脏组织病理切片观察:肉眼观察空白对照组与实验组大鼠肝脏外观,发现其呈红褐色,表面光滑,质软有弹性;实验组大鼠肝脏个别出现水肿、体积增大。镜下观察空白对照组大鼠肝脏肝小叶结构完整,肝细胞以中央静脉为中心于小叶周围呈放射状排列,大小均匀,肝细胞间界限清晰。实验组大鼠肝脏肝小叶结构完整,肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列。实验组均有不同程度的肝细胞萎缩、肝窦扩张及肝细胞脂肪变性,整体损伤较轻,A2B2C1组出现一处点状坏死,见图1(封2)。

2.2.2 肾脏组织病理切片观察:肉眼观察空白对照组与实验组大鼠肾脏外观,发现其呈红褐色,蚕豆状,质地柔软,表面光滑无肿块,切面肾皮质与肾髓质分界清晰。镜下观察空白对照组大鼠肾脏结构完整,肾小球、肾小管形态正常,分布均匀,未见明显萎缩或增生,无明显炎症浸润。实验组大鼠肾脏结构完整,肾小球未见损伤,均以肾小管损伤为主,可见轻微扩张及炎细胞浸润。肾小管管壁无增厚,管腔内无结晶、沉淀,各实验组可见不同程度的刷状缘脱落,少见肾小管水肿,A2B2C1组可见明显小灶性炎细胞浸润,无明显纤维化,见图2(封2)。

2.3 正交设计分析:正交设计分析以三因素两水平的果糖水浓度、OAPS给药浓度、OAPS给药途径对实验大鼠尿酸影响的数据进行计算及方差分析。使用Minitab 19软件对各因子进行极差分析。可从均值响应表中得出果糖浓度对大鼠尿酸影响最大,取值为水平1(5%);其次为OAPS给药途径,取值为水平1(灌胃);OAPS给药浓度对大鼠尿酸影响相对较小,为次要因素,取值为水平1 100 mg/(kg·d)。说明3个因素的影响排序为果糖水浓度>OAPS给药途径>OAPS给药剂量。综合分析正交最优组合为A1B1C1,见表6。

表6 大鼠尿酸水平极差分析

3 讨论

本研究选用果糖联合氧嗪酸钾使大鼠体内尿酸水平升高,从而构建大鼠高尿酸血症模型。刘杰[10]采用浓度为5%和10%的果糖联合氧嗪酸钾100 mg/(kg·d)造模,发现浓度为5%的果糖引起的大鼠肝肾损伤较小,更适合应用于控制和治疗高尿酸血症的药物筛选。Dhouibi等[11]连续15 d 对大鼠进行250 mg/(kg·d)氧嗪酸钾腹腔注射,建立慢性高尿酸血症模型,而15 d 后停止腹腔注射,大鼠尿酸逐渐恢复至正常水平。Patil等[12]比较了几种已经报道的高尿酸血症模型,发现同种药物在不同给药途径下(如灌胃、腹腔注射、关节内注射)可能导致不同的结果。本课题采用正交设计开展实验,实现了不同给药途径和给药浓度构建高尿酸血症大鼠模型的探究。

在正交设计实验下,4个实验组中仅有A1B1C1组大鼠尿酸水平持续上升,上升程度不高但整体呈现缓慢稳定上升趋势,且第8周大鼠尿酸水平与空白对照组比较有统计学意义(P<0.05),其余组别大鼠尿酸水平上升均不明显,这可能是由于该组果糖水摄入量远高于其他各组,过量果糖水的摄入引起了尿酸代谢异常,很好地模拟了长期高果糖摄入导致的高尿酸血症。整个实验期间血清肌酐整体呈上升趋势,第8周A1B1C1组与A2B2C1组比较差异有统计学意义(P<0.05),结合2组肾脏病理切片,发现确有轻微肾脏损伤;血清尿素氮水平无明显变化,仅在第2周出现组间差异(P<0.05),这些结果表明各组大鼠肾脏组织均出现了不同程度的损伤。大鼠肝脏组织病理切片结果显示,各组大鼠肝脏组织出现轻微损伤,少见肝细胞脂肪变性,可能与高果糖的摄入有关。有研究[13-15]证实长期摄入果糖会引起大鼠产生脂肪肝的病理改变,这种改变通常出现在高果糖摄入的第8周,这与本实验观察的结果相符。

正交设计结果分析显示,果糖水浓度对模型尿酸水平升高影响最大,其次为OAPS给药途径,给药浓度影响相对较弱。5%果糖水对于该模型的影响最大,OAPS灌胃次之。本实验周期较短,腹腔注射未出现不良反应,但基于氧嗪酸钾不溶于水的特性,腹腔注射极易引起腹腔积水等不良反应。出于建立长期稳定的高尿酸血症模型考虑,选取灌胃的给药方式对大鼠的刺激较轻,构建的高尿酸血症模型也更好[16]。此外,高浓度的氧嗪酸钾造模对肾脏损伤较大[17-18],且尿酸升高极不稳定。故结合本实验正交分析各因子效应程度,初步推断最优组合为A1B1C1组。

结合基础数据分析、正交设计结果与肝、肾组织HE染色病理改变,本研究认为在不同果糖浓度、不同OAPS剂量及不同给药方式下探索的最优高尿酸血症大鼠模型配伍为5%果糖联合100 mg/(kg·d)OAPS灌胃。