固态发酵橄榄渣制备枯草芽孢杆菌微生态制剂研究

林 瑾, 时祥柱, 王芳婷, 陈炳钿

(1.闽江师范高等专科学校 化学与生物技术学院,福建 福州 350109;2.福建省新闽科生物科技开发有限公司 研发部,福建 福州 350007)

0 引言

橄榄是橄榄科橄榄属乔木植物,含有丰富的膳食纤维、维生素、单宁、黄酮等生物活性物质,具有清热解毒、利咽化痰、生津止渴之功效[1].随着加工技术的进步,以橄榄为原料的一系列加工食品受到了消费者的青睐,如橄榄汁、橄榄茶、橄榄酒等[2-5].随着橄榄产品类型的不断丰富,其生产过程中的副产物橄榄渣的产量也大幅增加.在一些地中海国家,橄榄渣常被添加进饲料中,用于喂养反刍家畜[6].国内也有研究发现,在饲料中添加一定比例的橄榄渣可以改善动物的营养品质,如提高兔肉的多种不饱和脂肪酸含量[7];提高青脚麻鸡的生产性能、免疫功能和新城疫抗体水平[8];改善鸡肉的屠宰性能[9];提高水牛乳中天然抗氧化物质的浓度,并降低饱和与不饱和脂肪酸的比例等[10].

枯草芽孢杆菌是常见的饲料益生菌,常被用在制备微生态制剂时替代饲用抗生素[11],目前已被应用于禽类、畜类和水产类养殖中.枯草芽孢杆菌的添加有利于提高动物的免疫功能,维持肠道健康,并促进其生长[1213].目前,通过固态发酵制备枯草芽孢杆菌益生菌制剂的原料主要有麸皮、豆粕、花生粕、酱渣等[14-16],这些原料中膳食纤维的含量较高,而橄榄渣同样具有丰富的膳食纤维,但目前利用橄榄渣作为制备固态发酵枯草芽孢杆菌制剂的相关研究却较少.

本研究以橄榄汁生产过程的副产物橄榄渣为培养基,添加尿素作为氮源后接种枯草芽孢杆菌进行固态发酵.通过单因素及正交试验研究最适宜的发酵条件,并对发酵前后的总膳食纤维、真蛋白、单宁含量的变化进行分析对比,以期探索出一种实用有效微生态制剂的制备方法,同时提高橄榄渣的附加值,为橄榄渣资源回收再利用提供理论依据.

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

橄榄渣来自橄榄汁生产车间.枯草芽孢杆菌(ATC6633)购于上海保藏微生物有限公司.

1.1.2 主要培养基

斜面培养基:牛肉膏1.5 g、琼脂粉10 g、蛋白胨5 g、NaCl 2 g,定容至500 m L,p H 调至7.0,120℃灭菌20 min.

液体种子培养基:牛肉膏1.5 g、蛋白胨5 g、NaCl 2 g,定容至500 m L,p H 调至7.0,120℃灭菌20 min.

固态发酵培养基:橄榄渣250 g、去离子水250 m L、K2HPO40.2 g、尿素2 g、MgSO4·7H2O 0.1 g,120℃灭菌20 min.

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

取适量橄榄渣用蒸馏水清洗,4层纱布过滤,置于50℃烘箱中烘干,粉碎,过40目筛,备用.

1.2.2 种子液的制备

在无菌条件下,将保藏的菌株转接至斜面培养基,37℃恒温培养24 h后活化.向活化的斜面培养基中加入2 m L生理盐水洗脱孢子,合并制成菌悬液.准确吸取1 m L孢子悬液至100 m L液体种子培养基中,于37℃和200 r/min 的条件下震荡培养24 h,获得种子液.

1.2.3 固态发酵培养

无菌条件下,取30 g固态发酵培养基于锥形瓶中,基础条件为:温度37℃,接种量5%,料液比1∶1(g/m L),发酵时间48 h.

1.2.4 培养条件单因素试验

(1)温度

控制其他因素不变,以发酵后的菌落数为指标,分别考察在30℃,32℃,34℃,36℃,38℃和40℃下发酵的活菌数.

(2)料液比

控制其他因素不变,以发酵后的菌落数为指标,分别考察料液比为1∶0.5,1∶1.0,1∶1.5,1∶2.0,1∶2.5和1∶3.0(g/m L)的条件下发酵的活菌数.

(3)发酵时间

控制其他因素不变,以发酵后的菌落数为指标,分别考察发酵时间为12 h,24 h,36 h,48 h,60 h和72 h的活菌数.

(4)接种量

控制其他因素不变,以发酵后的菌落数为指标,分别考察接种量为2%,4%,6%,8%,10%和12%条件下发酵的活菌数.

1.2.5 正交试验设计

根据单因素试验结果,设计L9(34)正交试验,研究温度、料液比、发酵时间和接种量4个因素在不同组合条件下对活菌数的影响.具体情况见表1.

表1 正交试验设计

1.2.6 菌落数的测定

采用平板活菌计数法,称取1 g发酵后的样品,加入10 m L 的去离子水,按10倍梯度稀释成不同倍数.吸取100μL置于牛肉膏蛋白胨琼脂培养皿中进行涂布,37℃培养24 h后进行菌落计数.

1.2.7 橄榄渣发酵前后营养成分变化分析

1.2.7.1 总膳食纤维的测定

样品前处理步骤参考文献[17]改良后的方法,总膳食纤维的测定步骤参考《GB 5009.88—2014食品中膳食纤维的测定》[18]中的方法.

1.2.7.2 真蛋白含量的测定

采用文献[19]的方法,将样品中的蛋白质经沸水提取后在碱性条件下用硫酸铜溶液沉淀,过滤和洗涤后用凯氏定氮法测定.该方法可将纯蛋白质和非蛋白质含氮物分离,避免无机氮源尿素对实验结果的干扰.

1.2.7.3 单宁的测定

采用分光光度法测定样品中的单宁含量,具体参考GB/T 27985—2011[20].

2 试验结果

2.1 单因素试验结果

2.1.1 温度的对菌落数的影响

温度是影响微生物生长的主要物理因素之一,不同温度对枯草芽孢杆菌菌落数的影响结果见图1.由图1可知,温度由30℃升至36℃时,菌落数逐渐增长,而36℃继续升至40℃,菌落数逐渐减少.其中,36℃时菌落数最多.这是因为枯草芽孢杆菌在较低温度下生长速度较缓慢,随着温度的升高,生长速度会逐渐加快,到达最适温度时,生长繁殖速度到达峰值,而超过最适温度后,枯草芽孢杆菌的生长速度受到抑制.因此,本试验中所用菌株的最适宜生长温度为36℃.

图1 温度的对菌落数的影响

2.1.2 料液比对菌落数的影响

培养基的含水量对微生物的生长及代谢能力有重要影响.水分参与了菌体内重要的生化反应,也影响生物大分子结构的稳定性,因此合适的料液比对发酵的效果具有重要意义.料液比对菌落数的影响情况见图2.

图2 料液比对菌落数的影响

从图2可知,枯草芽孢杆菌菌落数在开始时随料液比的降低而增加,在料液比为1∶2 时达到峰值,随后又逐渐下降.这是因为本研究所用的发酵原料主要为橄榄渣,橄榄渣中含有大量的膳食纤维,持水力和膨胀力较强[1,21].当料液比较高时,培养基中的水分少,且大部分水分被橄榄渣吸附,这导致培养基中的自由水含量较低,限制了菌体对营养物质的利用率.而培养基中的自由水含量逐渐升高后,营养物质溶解在这部分自由水中,可以提高菌株对营养物质的利用率,因此,菌落数在开始时随料液比的降低而增加.而当料液比低于1∶2时,培养基中含水量过高,又会影响培养基内的溶氧量,从而影响菌体的生长[22],所以菌落数又逐渐下降.因此,本研究发酵培养基的最适宜料液比为1∶2.

2.1.3 发酵时间对菌落数的影响

不同发酵时间枯草芽孢杆菌的菌落数变化趋势见图3.

图3 发酵时间对菌落数的影响

由图3可以看出,在前36 h内,菌落数随时间的延长而增加,12 h～24 h 内增长速度比较缓慢,24 h～36 h内增长速度变快.这是由于培养基原料为橄榄渣,含有较多的膳食纤维大分子物质,在发酵前期,可供菌体直接利用的小分子糖类浓度较低,因此菌落数增长缓慢,而随着发酵时间的延长,菌体酶系逐渐活跃,代谢逐渐旺盛.研究表明,枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶[23-25],将部分大分子的膳食纤维分解为小分子糖类,更有利于菌体代谢速率的提高,因此菌落数的增长速度变快.36 h 后,菌体的生长进入稳定期,菌落数变化不大且有微小的下降趋势,这可能是由于其生长限制因子耗尽、有害代谢物累积或生长空间受到限制等造成的[26].

2.1.4 接种量对菌落数的影响

接种量对枯草芽孢杆菌菌落数的影响见图4.

图4 接种量对菌落数的影响

由图4可知,接种量由2%增至8%时,菌落数逐渐增加,这是因为接种量越大,菌株生长的延滞期越短,因此接种量过小不利于提高生产效率.而接种量超过8%时,菌落数略微下降,这是因为接种量过大可能会导致溶氧量不足或移入代谢废物.因此在单因素试验中,最适宜的接种量为8%.

2.2 正交试验优化结果

本文的正交实验结果见表2.

表2 正交试验结果

从表2可知,影响菌落数的因素从大到小的顺序为:发酵时间、料液比、温度、接种量.其中,试验组中的最优组合为A2B2C3D1,但根据试验K值计算出的最优组合为A2B2C2D1.因此,对这两个组合条件进行验证试验,试验结果为,A2B2C3D1组合条件的菌落数为7.26×109CFU/g,而A2B2C2D1组合条件的菌落数为7.02×109CFU/g.因此,最优的组合条件为A2B2C3D1,即发酵温度为36℃,料液比为1∶2,发酵时间为48 h,接种量为6%.

2.3 发酵前后培养基部分营养成分变化情况

在正交试验优化的固态发酵条件下,对发酵前后的橄榄渣固态培养基中的膳食纤维、蛋白质、单宁3种成分进行分析,结果见表3.

表3 发酵前后营养成分变化情况/%

由表3可知,发酵后总膳食纤维含量降低.经枯草芽孢杆菌固态发酵后,橄榄渣中大分子膳食纤维含量降低,由起始的81.5%下降至74.5%.这可能是由于枯草芽孢杆菌能够分泌纤维素酶,将大分子纤维素分解为小分子的可溶性糖和还原糖造成的.国内一些研究结论也证明了枯草芽孢杆菌具有良好的产纤维素酶能力,如文献[23]利用枯草芽孢杆菌制作麸曲可产β-葡聚糖酶等3 种纤维素酶;文献[24]对一株枯草芽孢杆菌的培养条件进行优化后,其纤维素酶产量大幅提高;文献[25]在探究枯草芽孢杆菌对雷竹笋膳食纤维含量的影响时发现,枯草芽孢杆菌可以增加可溶性糖和还原糖的含量.从这一角度来看,枯草芽孢杆菌有助于将橄榄渣中大分子膳食纤维分解为易于利用的营养物质,从而提高微生态制剂的营养价值.

发酵后真蛋白含量有所提高.发酵产物中的真蛋白含量由发酵前的4.52%提高至5.06%.这是因为枯草芽孢杆菌可利用培养基中的无机氮源合成蛋白质或小分子肽.这有利于提高微生态制剂整体的营养价值.

发酵后单宁含量显著下降.单宁是一种多酚类物质,在橄榄中含量较高,也是苦涩味产生的重要原因,会影响饲料的风味和适口性[27-28].此外,单宁也是饲料中的一种抗营养因子,含量过高会降低饲料的利用率[1].本研究中,橄榄渣原料经120℃灭菌后,单宁含量由最初的0.85%下降至0.14%,经枯草芽孢杆菌发酵后继续下降至0.04%,比未处理前降低显著,一方面是因为单宁易在高温条件下降解;另一方面是由于微生物可能分泌单宁酶,随着发酵时间的延长,导致单宁含量进一步降低.

3 结论

本研究以橄榄汁生产中的副产物橄榄渣为原料,接种枯草芽孢杆菌制备益生菌饲料并对其固态发酵条件进行优化.试验结果表明,最佳发酵条件为:温度36℃,料液比1∶2,发酵时间48 h,接种量6%,发酵后的枯草芽孢杆菌菌落数可达7.26×109CFU/g,此外,橄榄渣中的总膳食纤维含量降低,真蛋白含量上升,单宁降解率提高.而这有利于提高饲料的品质.

本文探究的枯草芽孢杆菌最适的生长条件是指其生产速率最快时的发酵条件,并不一定是代谢产物积累最快的生长条件.因此,以橄榄渣为主要固态培养基发酵益生菌,其产生蛋白质、纤维素酶等生物活性物质的最佳条件还有待于进一步探究.