基于HS-SPME-GC-MS分析不同基酒装量对美乐葡萄蒸馏酒挥发性成分的影响

郭亚芸，邵学东，张正文，李 勃，薛 伟，史红梅,

（1.山东省葡萄研究院，山东 济南 250100；2.君顶酒庄有限公司，山东 蓬莱 265607；3.烟台诚达蒸馏设备有限公司，山东 烟台 264000）

葡萄蒸馏酒是以葡萄为原料，经发酵、蒸馏、调整勾兑而成的饮料酒[1]。蒸馏酒不经橡木桶陈酿，因此，很好的保留了葡萄的品种香和发酵香，且生产周期远低于白兰地产品[2]，因具有纯正优雅的果香，清爽舒适的口感，与高度粮食白酒相比，辛辣刺激感轻微，深受消费者喜爱。对于酿酒原料的选择，应该选择具有弱香或者中性香的酿酒葡萄[3-4]。“美乐”作为世界栽种面积第2大的酿酒葡萄品种，在胶东半岛产区广泛种植，但其品种特性在该产区没有较好的表现，酒体偏瘦弱，特征香气不突出。因此，本研究试图以胶东半岛产区“美乐”为酿酒原料，尝试开发具有典型特性的葡萄蒸馏酒产品。

葡萄蒸馏酒是一个由水、乙醇和微量挥发性成分组成的一个相当复杂的混合体系[5]，而微量的挥发性成分决定着葡萄蒸馏酒的独特风味，也是决定葡萄蒸馏酒感官和质量参数的重要指标[5-6]，在蒸馏酒的风格与质量方面起着重要作用。然而，影响蒸馏酒挥发性成分的因素很多[7]，比如葡萄品种及成熟度[8-9]、发酵条件[10]、蒸馏工艺[11-13]等。其中，蒸馏工艺对蒸馏酒香气起着至关重要的作用，蒸馏工艺不当或设备有缺陷，葡萄蒸馏酒会丧失典型性，产生缺陷，从而降低葡萄蒸馏酒品质[14]。中链脂肪酸乙酯是含6～12 个碳原子的脂肪酸乙酯，如己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和十二酸乙酯等[15-16]。中链脂肪酸乙酯作为酵母次生代谢产物，具有果香，甜香和浓郁的发酵香，对酒体呈香有非常重要的贡献[17]。此外，中链脂肪酸乙酯，这类独特的芳香物质，可以帮助减轻饮酒者的压力，给人一种愉悦感[18]。相比于其他酵母源香气，中链脂肪酸乙酯具有较低的阈值[19]，它们浓度的微小变化也会强烈影响其最终风味和口感[17]。因此，考察酒身中链脂肪酸乙酯的含量和香气活性值（odor activity values，OAV）对蒸馏酒新产品的开发具有重要意义。

薛氏壶式蒸馏器[20]由烟台诚达蒸馏设备有限公司生产的专利产品，近几年在葡萄和其他水果蒸馏酒的生产企业里得到广泛的应用。该设备在构造上借鉴了夏朗德壶式蒸馏器和阿尔马涅克蒸馏器的优点，创造性地采用多蒸馏釜，热能回收，多管路协同的蒸馏方式，即先将其中一釜加热，形成蒸发及回流过程，产生的酒头由酒头出酒管排出，之后的酒气经酒身出酒管通过预热器，对葡萄酒基酒进行预热的同时自身冷凝，得到原葡萄蒸馏酒。酒尾直接通过酒尾管路串入下一个蒸馏釜，以此实现多釜间的间歇性蒸馏转换，进行连续一次蒸馏。薛氏双釜蒸馏设备的蒸馏效率是传统夏朗德壶式蒸馏设备的3～4 倍，冷却水能耗节省约70%，真正实现了低耗、高效蒸馏[14]。酒身相当于最终的商业产品，是馏分的重要部分。蒸馏釜基酒装量是蒸馏前需要考虑的一个必要的蒸馏酒工艺参数，基酒装量不同，可以引起蒸馏酒挥发性成分的不同，并且影响蒸馏效率和能耗，传统壶式蒸馏的原料装量为锅容的2/3～4/5[14,21-22]，目前，国内外蒸馏酒方面的研究还鲜见薛氏蒸馏基酒装量对酒身挥发性成分影响的报道。因此，本研究考察薛氏蒸馏的原料装量对酒身挥发性成分的影响，进而为美乐蒸馏酒产品的开发提供理论依据。

本研究采用单釜实际体积330 L的薛氏双釜蒸馏器对美乐葡萄酒进行蒸馏，顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用（headspace solid-phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GCMS）技术对基酒装量分别为150、200、250 L的美乐葡萄蒸馏酒酒身（简称酒身）的挥发性成分进行分析，并结合主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）两种统计学方法对3 种装量的酒身挥发性物质进行分析。以期获得美乐葡萄蒸馏酒的最佳蒸馏工艺条件，并为今后深入研究美乐葡萄蒸馏酒品质提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄：美乐，栽种时间2003年，砧木SO4，品系M181，气候条件为受海洋影响的温带季风大陆性气候，土壤条件为沙质棕壤土。

NaCl（分析纯）国药集团化学试剂有限公司；标准品：己酸丁酯（内标）、4-甲基-2-戊醇（内标）、2-辛醇（内标）、叔戊醇（内标）、苯乙醇、3-甲基-1-丁醇、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸异戊酯、正构烷烃（C7～C30）美国Sigma-Aldrich公司；标准品：十二酸乙酯、十四酸乙酯、十六酸乙酯 中国上海源叶生物科技有限公司；超纯水由Millipore-Q超纯水系统制得。

1.2 仪器与设备

QP2010 ULTRA气相色谱-质谱联用仪及工作站（配AOC-6000多功能自动进样器）日本Shimadzu公司；80 µm DVB/CWR/PDMS萃取头 瑞士CTC Analytics公司；HP-INNOWax毛细管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）、7890B 气相色谱仪（配CPWA X-57CB capillary column（50 m×0.25 mm，0.2 μm）毛细管柱）美国Agilent公司；CD-GC300 L薛氏双釜蒸馏器（主体设备包括：蒸馏釜二台，基酒介质热能交换器一台，二次水冷却塔一台，整体操作平台车一套。蒸馏单釜体积330 L，电加热内加装3 根各5 kW 380 V电加热管、蒸汽紫铜盘管各一套。顶端配回流提纯球及鹅颈管，设备整体长2 m、宽900 m、高度2 m）。

1.3 方法

1.3.1 美乐葡萄酒酿造工艺

葡萄采收→原料筛选→除梗破碎→气囊压榨取汁→清汁入罐→接种酵母菌→控温发酵→监测温度和密度→发酵结束→自然澄清。

1.3.2 美乐葡萄酒蒸馏工艺

澄清后的美乐葡萄酒采用薛氏双釜蒸馏器（标为A、B釜）进行蒸馏，基酒装量分别为150、200、250 L，蒸馏时蒸汽流量为20 L/h。首先加热A釜，计为第1釜，掐去占总乙醇体积分数1.5%的酒头，继续蒸馏，当馏出物的乙醇体积分数降到55%时，中馏分蒸馏结束；低度酒液通过酒气管进入B釜基酒内继续蒸馏，掐去占总乙醇体积分数1.5%的酒头，当馏出物的乙醇体积分数降到55%时，中馏分蒸馏结束，计为第2釜；低度酒液通过酒气管进入A釜基酒内继续蒸馏，计为第3釜，继续蒸馏。以此A、B釜循环蒸馏至第5釜，当馏出液乙醇体积分数降至55%以下时计为酒尾，馏出液乙醇体积分数降至1.0%时蒸馏结束。将所得蒸馏酒密封后，于常温下储藏，用于后续的分析检测。

1.3.3 美乐葡萄酒理化指标的测定

总糖、总酸、挥发酸、乙醇体积分数等常规理化指标参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定；pH值用pH计直接测定。每个样品做3 个平行实验。

1.3.4 美乐葡萄蒸馏酒甲醇的测定

蒸馏过程中，酒身甲醇含量的动态监测按照GB 5009.266—2016《食品中甲醇的测定》要求的内标毛细管柱定量分析。取酒身样品10 mL于试管中，加入0.1 mL叔戊醇内标溶液，混匀，1.0 µL直接进样，进样口温度：250 ℃，分流比（20∶1，V/V），载气流量：1.0 mL/min，FID检测器温度：250 ℃，柱温采用程序升温：起始柱温40 ℃，保持1 min，以4 ℃/min升至130 ℃，最后，以20 ℃/min升温至200 ℃，保持5 min。每个样品做3 个平行实验。

1.3.5 美乐蒸馏酒挥发性组分的测定

酒身挥发性成分的测定采用HS-SPME-GC-MS法，取6 mL稀释至乙醇体积分数10%的酒样加入到20 mL顶空瓶中，同时加入1.5 g NaCl、10 µL己酸丁酯（质量浓度0.251 4 g/L）、10 µL 2-辛醇（质量浓度0.105 0 g/L）、10 µL 4-甲基-2-戊醇（质量浓度1.020 0 g/L）3 种内标。用螺纹瓶盖封闭，放入自动进样器托盘，振摇器转速为450 r/min，50 ℃平衡10 min，通过隔垫插入萃取头，萃取30 min，插入GC-MS进样口解吸10 min，进行GC-MS分析。每个样品做3 个平行实验。GC条件：高纯氦气，分流进样（5∶1），进样口温度250 ℃，柱温采用程序升温：起始柱温45 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升至130 ℃，最后，以5 ℃/min升温至230 ℃，保持5 min，恒流模式，流量1 mL/min。MS条件：色谱-质谱接口温度250 ℃，离子源温度200 ℃，电离模式为电子电离源（electron ionization，EI），轰击能量70 eV，全扫描模式，质量数范围m/z30～500。

利用质谱数据库NIST 17和NIST 17S进行相似度检索，通过计算保留指数（retention index，RI），并参考相关文献报道的RI进行综合定性酒样中挥发性成分。对有标准品的10 种挥发性化合物，通过在体积分数10%乙醇溶液中稀释5 级得到标准溶液，通过绘制目标香气化合物的内标标准曲线进行定量分析（表1）。其余无标准品的挥发性化合物通过内标4-甲基-2-戊醇进行半定量分析，计算方式如下：

表1 HS-SPME-GC-MS 法挥发性化合物的标准曲线Table 1 Standard curves for volatile compounds determined by HS-SPME-GC-MS

1.4 统计学分析

本研究使用WPS软件，对不同装量的葡萄蒸馏酒样品中挥发性组分进行T检验（P＜0.05）分析，使用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析（ANOVA），使用SIMCA 14.1软件进行PCA和OPLS-DA，其余图形使用Graph Pad Prism 9.4.0软件绘制。

2 结果与分析

2.1 美乐葡萄酒理化指标

测得葡萄酒总糖质量浓度1.6 g/L，总酸质量浓度6.2 g/L，pH值为3.12，挥发酸质量浓度0.29 g/L，乙醇体积分数13.56%。

2.2 不同基酒装量酒身中甲醇含量分析

甲醇在人体内氧化为甲醛、甲酸，具有很强的毒性，尤其对视神经的毒性作用最大[23]。前人的研究发现，色谱法检测蒸馏酒中甲醇时，内标毛细管柱法优于外标填充柱法[24]，因此，本研究在检测甲醇时，按照GB 5009.266—2016《食品中甲醇的测定》提供的内标毛细管柱法检测。

本研究考察了蒸馏工艺中150、200 L和250 L 3 个基酒的不同装量，每个装量条件下第1～5釜酒身甲醇的含量，结果显示，所有酒身样品中甲醇质量浓度在（177.35±0.49）～（198.06±1.16）mg/L之间，远低于国标规定的2.00 g/L（以无水乙醇计）[1]，符合国家标准要求。

2.3 不同基酒装量酒身挥发性物质分析

为研究不同基酒装量对蒸馏酒酒身挥发性物质的影响，本研究利用HS-SPME-GC-MS法对3 种不同基酒装量蒸馏酒酒身的挥发性物质进行定性和定量分析。由表2可知，3 种基酒装量酒身挥发性物质共检测出74 种。基酒装量为150 L时的酒身共检测出67 种，总质量浓度（127 042.12±5 595.27）μg/L。其中，酯类37 种，醇类8 种，醛酮类4 种，酸类2 种，萜烯类与C13-降异戊二烯类5 种，缩醛类4 种，萘及萘的衍生物4 种，其他类3 种；基酒装量200 L时酒身共检测出67 种，总质量浓度（117 371.70±2 904.73）μg/L，其中酯类37 种，醇类10 种，醛酮类3 种，酸类2 种，萜烯类与C13-降异戊二烯类5 种，缩醛类3 种，萘及萘的衍生物4 种，其他类3 种；基酒装量为250 L时酒身共检测出64 种，总质量浓度（128 683.95±3 599.54）μg/L，其中酯类37 种，醇类10 种，醛酮类2 种，酸类2 种，萜烯类与C13-降异戊二烯类6 种，缩醛类3 种，萘及萘的衍生物2 种，其他类2 种。不同基酒装量蒸馏酒酒身总挥发性物质含量无显著差异。

表2 酒身中挥发性物质含量和RITable 2 Concentrations and RI of volatile compounds in distilled wine samples

酯类物质是蒸馏酒香气最主要的贡献物质[25]，主要通过发酵和蒸馏过程中醇类和有机酸酯化作用生成，大部分酯类化合物呈现花香和果香。结果显示，基酒装量为150、200 L和250 L时蒸馏酒酒身中酯类物质均为37 种，其质量浓度分别为（47 608.96±2 714.04）、（33 640.96±677.75）μg/L和（40 205.53±291.52）μg/L，150 L 时酯类物质含量显著高于200 L 和250 L（P＜0.05）。虽然醇类物质总含量在酒体中占比最大，但是3 个不同酒身样本中醇类物质总质量浓度分别为（70 593.84±2 531.84）、（74 909.78±2 111.17）、（79 354.43±3 842.86）μg/L，无显著差异。

2.4 基酒装量对酒身中链脂肪酸乙酯的影响

本研究以HS-SPME-GC-MS法对基酒装量为150、200、250 L的酒身中己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和十二酸乙酯进行了定量分析（表1），含量如图1所示。不同酒身中4 种中链脂肪酸乙酯含量和OAV大小均为150 L＞250 L＞200 L。其中癸酸乙酯含量最高，辛酸乙酯含量次之，这与前人的研究结果一致[16]，但是，辛酸乙酯OAV最大，达到411.84，依次是己酸乙酯、癸酸乙酯和十二酸乙酯，4 种中链脂肪酸乙酯中癸酸乙酯虽然含量高，但是，最主要的特征风味物质是辛酸乙酯，赋予酒体浓厚的花香和果香。当基酒装量为150 L时，酒身中辛酸乙酯的OAV显著高于其他两个装量（P＜0.05）。因此，基酒装量为150 L时的酒身花香果香更加浓郁。

图1 酒身中链脂肪酸乙酯含量（a）和OAV（b）Fig.1 Contents (a) and OAV (b) of medium-chain fatty acid ethyl esters in distilled wine samples

2.5 不同基酒装量酒身挥发性物质的统计学分析

由于3 个基酒装量条件下的蒸馏酒酒身中挥发性化合物的总含量无显著差异，因此，本研究采用多元统计分析方法对各挥发性化合物进行了具体鉴别。为了观察挥发性化合物的分布，本研究采用PCA对其进行分析，如图2a所示，位于不同象限的3 个样本分别相距较远，说明不同基酒装量的酒身的挥发性成分存在显著差异，PC1对整体方差的贡献率是41.8%，PC2对整体方差的贡献率是30.7%，累计贡献率为72.5%。对150 L酒身样品有积极影响的高含量物质有A16、A33、A19、A11和A6，低含量物质有A35、C6、F2、C3、E6、A36、A14和A13，其中本研究2.4节着重讨论的4 种中链脂肪酸乙酯与150 L酒身样品有强烈的相关性，这些发现与前人研究[14,26]一致，己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯是蒸馏酒酒身的关键挥发性化合物。对200 L酒身样品有积极影响的物质仅有C5，对250 L酒身样品有积极影响的物质仅有E1。

图2 蒸馏酒样品中挥发性化合物的PCA图Fig.2 PCA plots of volatile compounds in distilled wine samples

PCA结果显示，对150 L酒身样品有积极影响的化合物包括酯类9 种、醛酮类2 种、萜烯类化合物1 种和缩醛类化合物1 种，对200 L和250 L酒身样品有积极影响的挥发性物质都仅有1 种，分别为醛酮类、C13-降异戊二烯类。结果显示，蒸馏工艺中，随着填料量的增加，对酒身样品有积极影响的挥发性物质逐渐减少，这可能因为蒸馏过程中，填料量越大，受热越不均匀，塔顶温度偏低、塔底液位波动较大，导致香气的释放受到影响。

如图2b所示，PC1对整体方差的贡献率是49.5%，PC2对整体方差的贡献率是35.3%，累计贡献率为84.8%。研究发现，醇类丰富的蒸馏酒中，酸类物质也更加丰富，且与醛酮类物质呈负相关，这可能与醇类物质氧化形成了醛酮类物质有关。在发酵期间酯类物质主要由醇类物质和酰基辅酶A通过酶促反应与酸生成[25,27]，因此，醇和酸在蒸馏酒样品中与酯呈负相关，与前人的研究结果一致[28]。

为进一步识别样本特征，验证PCA结果的合理性，建立了OPLS-DA模型，本模型解释变异数＝0.997，预测能力Q2＝0.969，说明模型优秀。在OPLS-DA得分图中（图3），基酒装量分别为150、200、250 L的酒身被清晰地分开，说明该模型可将3 种工艺的酒样明显分离，与上述PCA模型一致。

图3 不同填料量的蒸馏酒样本的OPLS-DA得分图Fig.3 OPLS-DA score plot of distilled wine samples

为进一步分析两组之间的差异挥发性化合物，进行了变量投影重要度（variable importance for the projection，VIP）分析，VIP值可以量化每个变量对样品分类的贡献，VIP＞1可认为该变量为该判别模型的潜在差异物质[29]，VIP值越大说明该物质在判别过程中的贡献越大[30]。

根据OPLS-DA模型VIP值（＞1）和T检验的P值（P＜0.05），确定了不同基酒装量的蒸馏酒酒身的潜在差异物质（表3）。

表3 3 种不同填料量酒身的差异挥发性物质Table 3 Differential volatile compounds in distilled wine samples

由表3可知，基酒装量150 L vs 200 L的酒身样品中，共鉴定出19 种潜在差异挥发性物质，其中，酯类9 种，醇类2 种，羰基化合物6 种，萜烯类1 种，缩醛类1 种。基酒装量150 L vs 250 L的酒身样品中，共鉴定出14 种潜在差异挥发性物质，包括酯类4 种，醇类2 种，羰基化合物3 种，萜烯类1 种，萘及其衍生物2 种，缩醛类1 种和其他物质1 种。基酒装量200 L vs 250 L的酒身样品中，共鉴定出13 种潜在差异挥发性物质，其中，酯类7 种，羰基化合物3 种，萜烯类1 种，萘类1 种和其他物质1 种。因此，200 L vs 250 L酒身样品中差异挥发性化合物最少，150 L vs 200 L酒身样品中差异挥发性化合物最多。研究结果进一步表明OPLS-DA结果与PCA结果一致，可以证明其合理性。

3 结论

本研究考察不同基酒装量对美乐葡萄蒸馏酒酒身挥发性物质的影响，旨在探究使用薛氏双釜蒸馏器时美乐葡萄蒸馏酒的最佳蒸馏条件。通过气相色谱-氢火焰离子化检测器法分析蒸馏酒酒身样本中甲醇含量远低于国家标准。HS-SPME-GC-MS法对3 个不同基酒装量条件下的蒸馏酒进行分析，装量为150、200、250 L时的酒身，分别检出67、67、64 种挥发性化合物。为了进一步研究不同基酒装量对挥发性物质的影响，利用SIMCA 14.1软件对挥发性成分进行PCA和OPLS-DA。PCA结果显示，对基酒装量150 L蒸馏酒酒身有积极影响的挥发性化合物共13 种（酯类9 种、醛酮类2 种、萜烯类化合物1 种和缩醛类化合物1 种），对基酒装量200 L和250 L的蒸馏酒酒身有积极影响的挥发性化合物都仅有1 种，分别为醛酮类和C13-降异戊二烯类。研究发现，蒸馏工艺中采用150 L的基酒装量为最佳，OPLS-DA结果与PCA结果一致。该结果可用于美乐葡萄蒸馏酒生产过程中基酒装量的确定，以获得更高品质的成品美乐葡萄蒸馏酒，此外，本研究采用胶东半岛产区美乐葡萄为原料进行葡萄蒸馏酒产品开发，为胶东半岛产区美乐葡萄蒸馏酒香气化合物的研究提供了理论指导。