基于GC-MS/GC-O的不同地区红茶特征香气及分子感官分析

郑芳玲，甘诗雅，赵 蕾，陈颖琦，赵潇奕，姜 青，邱 桐，张 莹，郑鹏程，夏 涛，戴前颖

（安徽农业大学茶与食品科技学院，茶树生物学及资源利用国家重点实验室，安徽 合肥 230036）

红茶是中国六大茶类之一[1]，因为它独特和丰富的风味，成为了全球范围最受欢迎的茶类，占国际市场消费比例的80%以上[2]。我国红茶产地较为广泛，最有影响力的为安徽省祁门红茶[3]、湖北省宜昌红茶[4]、云南省滇红[5]和广东省英红[6]等，其采用的鲜叶原料不同、制作参数不同以及气候土壤等[7]存在差异，造就了不同地区红茶特定的香气类型。

气相色谱-质谱（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术和气相色谱-嗅闻（gas chromatography-olfactory，GC-O）技术等香气研究方法被广泛应用于水果[8-10]、酒类[11-12]、粮食[13-14]和茶叶[15-16]的风味分析中。很多科研工作者展开了对不同产地红茶的感官属性差异及物质基础的研究，如刘青青等[17]使用顶空固相微萃取和GC-MS联用对滇红和川红香气成分进行分析，结果表明香叶醇对两种红茶香气贡献最大；Niu Yunwei等[18]结合顶空固相微萃取、溶剂辅助风味蒸发和GC-MS等方法分析出芳樟醇、香叶醇等39 种化合物对金骏眉、祁红和滇红香气具有较高的香气贡献。Liu Panpan等[19]通过GC-O检测出壬醛、癸醛、(E)-2-壬烯醛、β-紫罗酮和1-辛烯-3-酮是不同地区珠茶香气的主要活性化合物。这些研究揭示了不同地区茶叶香气的化学基础，但与各自香气感官属性之间的相关性[20]尚未探明。

为探究不同地区的红茶香气在挥发性化合物和感官属性的相关性，本研究使用固相萃取（solid phase extraction，SPE）结合GC-MS联用技术、GC-O联用技术，并引入香气活度值（odor activity value，OAV）分析4 个地区红茶的特征香气及挥发性化合物，结合方差分析筛选出具有香气活性的关键差异化合物，拟建立不同地区香气轮廓雷达图及特征感官属性与差异化合物的相关性网络图，在分子水平上阐明不同地区红茶特征香气差异及化学基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从安徽、湖北、云南和广东的主要红茶产区分别收取12 个祁门红茶、13 个宜红、11 个滇红和12 个英德红茶。所有红茶均为2020—2021年制作，用铝箔袋密封存放于-20 ℃冰箱中。

C7～C40正构烷烃混合物（纯度99%）、癸酸乙酯（纯度99%）美国Sigma-Aldrich公司；甲基叔丁基醚（纯度99%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；戊烷（纯度9 9%）德国默克试剂公司；甲醇（纯度99%）美国天地公司。

1.2 仪器与设备

7890B-5977B GC-MS联用仪 美国安捷伦公司；8890 GC-O系统（配有5977B质量选择检测器、Sniffer 9100嗅闻仪）德国哲斯泰公司；Turbo Vap氮吹仪 瑞典Biotage公司；AR224CN电子分析天平（精确度0.000 1 g）、EX125DH分析天平（精确度0.000 001 g）美国OHAUS公司；超高速离心机美国赛默飞公司。

1.3 方法

1.3.1 茶叶感官审评

由1 名一级评茶师、4 名高级评茶员组成评价小组，根据GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》[21]，对4 种红茶的香气特征进行百分制审评。结合单项差别检验，根据GB/T 39992—2021《感官分析 方法学 平衡不完全区组设计》[22]对各地红茶样品香气进行Friedman秩和分析。最终确定了每个地区具有当地红茶代表性香气的3 个茶样，祁红（KBT）、宜红（CBT）、滇红（DBT）和英红（YBT）典型茶样分别编号为KBT 1～3、CBT1～3、DBT1～3和YBT1～3。

1.3.2 香气萃取

参考Feng Zhihui等[23]的方法，使用SPE法萃取茶汤香气。称取6 g茶，加入300 mL沸水（纯水）冲泡5 min后，滤出茶汤于500 mL锥形瓶中。冷却后转移至500 mL分液漏斗中，加入60 mL甲基叔丁基醚和戊烷混合溶液I（1∶4）充分振荡，取静置分层后的透明有机层，重复3 次。在有机层溶液中加入无水硫酸钠充分干燥，放置于氮吹仪中使用流速为0.5 L/min的温和氮气将萃取液浓缩至2 mL。用6 mL甲基叔丁基醚和戊烷混合溶液II（1∶1）活化SPE柱（505374，6 mL LC-Si，500 mg吸附剂）后，将2 mL浓缩液过柱，并用10 mL混合溶液II进行洗脱，收集溶液于10 mL氮吹小管中进行再次氮吹并浓缩至200 μL，保存于密封玻璃管中，存放在-20 ℃冰箱。

1.3.3 GC-MS分析条件

GC条件：DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）柱。升温程序为：50 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至230 ℃，以10 ℃/min升至280 ℃保持10 min。高纯度氦气（99.999%）为载气，柱恒定流速1.2 mL/min，进样口温度250 ℃。进样方式：手动液体进样，进样量为1 μL，分流比为5∶1。进样方式为手动液体进样。

MS条件：电子电离源，电子能量70 eV，质量扫描范围30～400 u，采集方式为Scan全扫描。

1.3.4 GC-O分析条件及嗅闻评价

色谱柱、进样方式、色谱条件、柱温箱升温程序、质谱检测条件和GC-MS分析条件相同，嗅闻仪传输线温度200 ℃，嗅闻口温度220 ℃。评价小组由4 名（3 女1 男，年龄22～24 岁）嗅闻员组成，在正式评价前均接受了至少半年的香气识别训练（每周1 次，每次1 h）。评价小组对嗅闻到的气味进行描述和强度评分，评分采用5点标度（1＝微弱、2＝较弱、3＝中等、4＝较强、5＝很强）。当有2 名以上评价员在同一时间点嗅闻到相同气味时，认为该气味确实存在。每个气味的强度值为所有评价员嗅闻到的评分平均值。

1.3.5 挥发性化合物的定性及定量

定性：根据Xiao Mingji等[24]的方法，根据C7～C40正构烷烃混合物在同一升温程序中谱图结果，计算样品各色谱峰保留指数，利用NIST 20.L谱库检索结果对挥发性物质进行定性。

定量：采用内标法定量。在300 mL茶汤中加入1 000 mg/kg的癸酸乙酯溶液10 μL作为内标，然后进行SPE萃取。通过比较各化合物的峰面积与内标物的峰面积，计算出各化合物的相对含量。

1.3.6 挥发性化合物的OAV计算

OAV计算公式如下：

式中：Ci为化合物在水中的含量/（μg/kg）；Ti为化合物在水中的阈值/（μg/kg）。

1.3.7 香气轮廓分析

GC-O嗅闻轮廓分析：参考Feng Tao等[25]的方法，根据评价小组GC-O嗅闻红茶香气浓缩液时得出的气味属性和强度值，可以将气味属性总结分类为花香、甜香、果香、草药香、木质香、青气和脂肪味7 种，将评价员对每个气味的评分的算数平均值进行加和，即为每种气味属性在GC-O中的香气强度。

感官香气轮廓验证分析：由GC-O评价小组对茶汤进行嗅闻，根据上述总结的7 种气味属性对茶汤香气进行评分，评分标准同1.3.4节。每个气味属性的强度值为所有评价员嗅闻的评分平均值。

1.4 数据统计分析

各区域红茶挥发性化合物含量及气味强度值均采用平均值。使用IBM SPSS Statistics 26.0软件进行方差分析；使用Tbtools绘制热图；使用XLSTAT 2016软件进行偏最小二乘（partial least squares，PLS）回归分析；使用Cytoscape绘制网络图；使用Excel 2016绘制雷达图和柱状图。

2 结果与分析

2.1 茶叶感官审评

4 种红茶的审评结果如表1所示。在外形上，祁红和宜红条索更紧细，英红和滇红条索紧结肥壮；在汤色上，4 种红茶没有明显的差异；在滋味上，祁红滋味鲜甜醇和，宜红滋味与祁红较为相似，滇红和英红滋味较前两者较浓醇，有独特的大叶种风味。在香气上，祁红在4 种茶样中香气最鲜甜，并带有花蜜香，香气细腻层次感丰富；宜红香气与祁红较相似，表现为甜香带花香，并有不同于祁红的轻微草药香；滇红香气表现为果甜香浓郁，有云南大叶种茶树的独特木质香和梅子香；英红香气表现为甜香浓郁，有类似草药的清凉感和大叶种木质香。在传统感官审评结果中，4 个地区的红茶具有不同的风味特征，尤其在香气因子上表现更明显的差异。由中小叶种茶树制成的祁红和宜红在感官审评中整体感觉较相似，由大叶种茶树制成的滇红和英红也具有更相似的风味特征。

表1 祁红、宜红、滇红和英红样品审评结果Table 1 Sensory evaluation of KBT,CBT,DBT and YBT

2.2 基于SPE-GC-MS分析不同地区红茶的挥发性化合物

利用SPE萃取茶汤中得香气成分，通过GC-MS对萃取的香气浓缩液进行定性和定量分析。在4 个地区的红茶典型香气样品中共检测出191 种挥发性化合物，在祁红、宜红、滇红和英红中分别检测到120、107、91 种和73 种挥发性化合物。祁红的挥发性化合物总含量为13 065.131 μg/kg，宜红的挥发性化合物总含量为9 188.539 μg/kg，滇红的挥发性化合物总含量为6 847.051 μg/kg，英红挥发性化合物总含量为5 186.974 μg/kg。由此可见，祁红和宜红的挥发性化合物种类及总含量远高于滇红和英红。祁红中化合物种类和含量均为最高，是英红的挥发性化合物含量2 倍以上。

由图1可知，4 个地区红茶样品在挥发性化合物组成上有明显的差别，但醇类、酸类、杂环类化合物和醛类在4 个地区红茶香气化合物中占比均较高，其中，醇、醛和酯类化合物在以往报道中亦是红茶中重要的香气类别[26]，具有低阈值、香气怡人[26]的特点。醇类挥发性化合物在所有茶样中含量均为最高；酸类挥发性化合物在祁红、宜红和滇红中含量较高，但在英红里仅占10.41%。杂环类挥发性化合物包括含氧类化合物和含氮类化合物，在滇红中含量占比较高，其次是英红、祁红和宜红。醛类挥发性化合物在祁红、宜红和滇红占比相似，但在英红中高达21.89%。酯类化合物在宜红和滇红中含量较高，分别占它们挥发性化合物总量的9.75%和8.41%，在英红中含量较低，占比3.74%。另外还检测到酮类（1.04%～5.86%）、苯环衍生物（2.13%～5.16%）和烯烃类化合物（0.14%～1.8%）在红茶中少量存在。含硫化合物仅在宜红中检测到二甲基硫，占宜红挥发性化合物总量的0.01%。

图1 4 个地区红茶的挥发性化合物种类相对含量Fig.1 Relative contents of volatile compounds in black tea from four regions

在检测到的191 个挥发性化合物中，通过方差分析发现167 个化合物在4 种红茶中含量差异显著（P＜0.05），这些差异化合物可能是4 种红茶香气感官属性存在差异的原因。

2.3 基于GC-O分析红茶关键差异挥发性物质

评价小组进行GC-O分析，并进行气味描述和强度评分。分别在祁红、宜红、滇红和英红中嗅闻到35、33、32 种和32 种香气活性化合物，其含量分布热图如图2所示。图中48 种化合物在4 种红茶中含量存在一定的差异，祁红和宜红的香气活性化合物种类及含量比滇红和英红更丰富。基于这些化合物的聚类，英红和滇红更为相似；宜红介于祁红和大叶种的英红和滇红之间；祁红在聚类中与其他3 类红茶差别较大。

图2 4 个地区红茶的差异化合物含量分布热图Fig.2 Heatmap of content distribution of differential volatile compounds in black tea from four regions

查询上述48 种化合物的阈值并计算其OAV，共筛选出24 种化合物的OAV＞1，对4 个地区红茶特征香气属性的表征有重要贡献（表2）。具有花香属性的香叶醇OAV在4 种红茶中均最高，其中在祁红中OAV高达16 581.33，其次依次是宜红（7 463.65）、滇红（2 832.13）和英红（467.96），它对各茶类香气品质起着重要作用。祁红中OAV＞100的为气味描述为甜香的γ-癸内酯（168.85）和草药香的水杨酸甲酯（165.82）；在宜红中OAV＞100的化合物为气味描述为甜香的月桂酸甲酯（383.01）；在滇红中OAV＞100的化合物为气味描述为青气的叶醇（245.39）和水杨酸甲酯（182.17）；在英红中OAV＞100的化合物为叶醇（137.54）。10＜OAV＜100的化合物，在祁红中有6 种，为β-紫罗酮、苯乙醇、蒎烯、萘、3,6-亚壬基-1-醇和δ-癸内酯；在宜红中有8 种，为水杨酸甲酯、苯乙醇、蒎烯、萘、(E,Z)-3,6-壬二烯醇、δ-癸内酯、(E)-3-己烯醇和(Z)-呋喃型氧化芳樟醇；在滇红中有8 种，为苯乙醇、蒎烯、(E,Z)-3,6-壬二烯醇、芳樟醇、δ-癸内酯、(Z)-呋喃型氧化芳樟醇、叶醇和(E,E)-2,6-壬二烯醛；在英红中有7 种，为水杨酸甲酯、γ-癸内酯、苯乙醇、萘、芳樟醇、(E)-3-己烯醇和(Z)-呋喃型氧化芳樟醇。

表2 24 种关键活性化合物OAV及嗅闻香气属性Table 2 OAV and aroma attributes of 24 key aroma-active compounds

以上24 种关键香气活性化合物在不同地区红茶样品中分布情况不同，在祁红、宜红、滇红和英红中分别有15、15、15 种和14 种关键香气活性化合物，且同一化合物在不同地区红茶中OAV不同。正是这些关键香气活性化合物的差异，造成不同地区红茶特征香气的感官差异。

2.4 基于GC-O建立不同地区红茶特征香气感官轮廓

将24 种关键活性化合物按照评价员嗅闻到的气味属性（花香、甜香、果香、草药香、木质香、青气和脂肪味）和同类气味的平均强度值总和制成雷达图，结果如图3蓝色线所示。评价员根据以上气味属性对茶汤进行嗅闻评分，每个气味属性的强度值取所有评价员的评分平均值，结果如图3红色线所示。由图3可知，4 个地区红茶在GC-O中得到的嗅闻轮廓与茶汤感官嗅闻轮廓基本相似，且与传统茶叶感官审评中的香气类型一致。祁红具有最强的花香属性和甜香属性；宜红花香强度仅次于祁红，同时表现较强的果香属性；滇红表现出最强的果香和木质香属性，甜香属性最弱；英红表现出最强的草药香和青气属性，较强的甜香属性。两种嗅闻轮廓图在草药香和木质香两种气味属性的强度表现出较大的差异，可能是由于在嗅闻茶汤时各化合物气味之间具有复杂的互作效应[28]。如有研究[29]发现β-大马酮可以加强肉桂酸乙酯的果香，也可以减弱2-甲氧基-3-异丁基吡嗪的草药味。在红茶香气的研究中，关键香气化合物之间的互作效应仍有待进一步研究。

图3 祁红（A）、宜红（B）、滇红（C）和英红（D）特征香气轮廓雷达图Fig.3 Radar maps of characteristic aroma profiles of KBT (A),CBT (B),DBT (C) and YBT (D)

2.5 不同地区红茶特征香气轮廓与关键活性化合物的相关性分析

为进一步探究4 种红茶的香气感官差异形成与关键活性化合物之间的相关性，通过2.4节感官轮廓中各香气属性强度与24 种关键活性化合物含量进行PLS回归分析和Pearson相关性分析。采用PLS回归分析确定感官属性（y变量，n＝7）与挥发性化合物（x变量，n＝24）之间的关系，结果如图4所示。4 个地区的红茶分布在不同的象限，各自与不同的特征香气感官属性和关键差异挥发性化合物存在相关性，可以直观分析该地区红茶区别于其他红茶的特征香气属性，如祁红与花香和甜香具有高相关性；宜红与草药香具有较高的相关性；英红与草药香、木质香和果香等具有高相关性；滇红与果香和木质香等具有较高相关性。

利用相关性网络图进一步直观探究感官属性和关键活性化合物的相关性，选取较高Pearson相关系数（ρ＞0.8），在7 个感官属性和24 种关键活性化合物中最终确定了最为关键的6 个感官属性和14 种化合物绘制了相关性网络图，如图5所示。香叶醇、γ-癸内酯、β-紫罗酮、苯乙醇、苯甲醇、吲哚和橙花醇参与形成了花香，这些化合物大都被报道为花香，虽然γ-癸内酯被报道为桃子、椰子味，但也在具有高扬花香的乌龙茶黄金桂中被大量检测到，可能通过与对其他化合物的相互作用，间接参与花香属性的呈现[30]。香兰素、叶醇、(E)-2-己烯醛和α-松油醇参与形成了果香；叶醇、(E)-2-己烯醛和α-松油醇参与形成了木质香等。值得注意的是，单一化合物参与了一种或多种香气属性的形成，如呈青草气的叶醇同时参与果香和木质香的形成；呈柑橘和花香的α-松油醇参与果香、青气和木质香的形成，并且α-松油醇是橙汁和月桂叶等的主要香气成分[31-32]；吲哚同时参与花香和甜香的形成，它对花香属性的贡献在大多数花香型乌龙茶中得到了广泛验证[33]，但本实验首次发现吲哚也参与了甜香的形成。总之，这14 种关键活性化合物是形成4 个地区红茶特征香气差异的主要原因。

图5 基于Pearson相关系数（ρ＞0.8）的4 个地区红茶特征香气属性和关键活性化合物的相关性网络图Fig.5 Correlation network between sensory attributes and key aromaactive compounds of black teas from four regions based on Pearson correlation coefficients (ρ >0.8)

3 结论

红茶香气成分中，醇类、醛类、酸类和杂环类挥发性化合物是红茶香气的主要组成类别。但在不同地区的红茶中，同一类别化合物在含量上具有明显的差别，可能是由于茶树种类、种植环境与气候的差别影响。本研究通过SPE-GC-MS、GC-O结合感官评价分析4 个地区红茶特征香气的感官属性及化学基础差异，计算OAV筛选出形成感官差异的关键活性化合物，并结合相关性分析，在分子水平上，阐明了4 个地区红茶特征香气轮廓及物质基础。

实验发现祁红的挥发性化合物含量远高于滇红和英红，可能是造成祁红“高香”的主要原因。结合方差分析和GC-O，筛选出24 种关键活性化合物（P＜0.05，OAV＞1）是形成4 个地区红茶香气差异的关键。已被报道过是红茶关键香气化合物的香叶醇，在本研究4 个地区红茶中都具有最高的OAV，其在祁红中最高（16 581.33），英红中最低（467.96）。水杨酸甲酯、苯乙醇、苯甲醇和芳樟醇也有较高的OAV，但在4 个地区红茶样品中OAV也各不相同，由此造就了各地区红茶特征香气轮廓的不同。

本实验基于评价员对GC-O和茶汤的嗅闻评分，以花香、甜香、果香、草药香、木质香、青气和脂肪味建立了4 个地区红茶特征香气轮廓，与茶汤嗅闻结果和传统感官审评结果一致。PLS回归分析和Pearson相关性分析表明花香与7 种关键活性化合物具有高相关性，分别为香叶醇、γ-癸内酯、β-紫罗酮、苯乙醇、苯甲醇、吲哚和橙花醇。果香与4 种关键活性化合物具有高相关性，分别为香兰素、叶醇、(E)-2-己烯醛和α-松油醇。青气与4 种关键活性化合物具有高相关性，分别为芳樟醇、2-庚醇、(E)-2-己烯醛和α-松油醇。甜香、草药香、木质香分别与2、1、4 种关键活性化合物具有高相关性。这些关键活性化合物在4 个地区红茶样品中组分不同、含量不同，从而形成了4 个地区红茶特征香气的差异，为科学描述不同产地红茶香气感官属性及化学基础提供了一定的理论支持。