异丙酚预处理内皮细胞来源的外泌体对氧化应激诱导心肌细胞坏死凋亡的影响

顾晓霞，庞 萍，王晶晶，文尧锋，胡 奎，陈 昊

（1.广东医科大学附属医院麻醉手术中心；2.广东医科大学附属医院临床科研中心，广东 湛江 524001）

异丙酚是烷基酸类麻醉药，不仅具有镇静麻醉的作用，还可抑制炎症反应，对抗机体氧化应激损伤，具有器官保护效应[1]。研究表明，在体外心肌缺血再灌注损伤中，异丙酚可减少氧自由基的生成，具有抗氧化损伤的作用[2-3]。更有临床研究证实，采用异丙酚全凭静脉麻醉的体外循环下心脏手术患者，血液中的氧自由基及炎症介质明显减少[4]。本课题组前期的研究发现，加入异丙酚-内皮细胞来源的微囊泡（MVs）后，缺氧再复氧诱导的内皮细胞损伤、氧化应激、线粒体损伤明显改善。外泌体是一类微囊泡物质，异丙酚预处理产生的外泌体可否通过抑制缺血再灌注时发生的心肌坏死性凋亡，来减少心肌细胞损伤和死亡，从而产生保护作用，尚未见研究报道。基于此，本研究旨在探讨异丙酚预处理内皮细胞来源的外泌体（p-exo）对氧化应激诱导心肌细胞坏死凋亡的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 提取与鉴定方法 异丙酚处理外泌体的分离提取和鉴定：采用人胚胎脐静脉内皮细胞（HUVECS），Propofol浓度25 μm处理6、12、24 h；Propofol浓度50 μm处理6、12、24 h；Propofol浓度100 μm处理6、12、24 h。找到异丙酚最适浓度及最佳处理时间。然后进行蛋白免疫印迹（WB）鉴定。采用H9C2心肌细胞系，用过氧化氢（H2O2）处理模拟细胞内缺血再灌注损伤，制备损伤模型。用PKH67标记外泌体，在激光共聚焦显微镜下观察外泌体摄取内化情况，确定心肌细胞能否很好地摄取外泌体，并通过对各分组荧光强弱的观察，判断各组外泌体摄入有无差异及外泌体摄取的最适共培养时间。利用不同条件处理下外泌体与损伤心肌细胞共培养，验证异丙酚处理来源的外泌体通过减弱坏死性凋亡对心肌细胞产生保护作用。

1.2 检测方法及指标 细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK8）检测细胞活性；AnnexinV-FITC/碘化丙啶（PI）检测细胞坏死性凋亡情况；通过透射电子显微镜检测细胞损伤情况。

1.3 统计学分析 使用SPSS 20.0及GraphPad Prism 7统计学软件，所有数据是至少三个独立实验的（），计量资料使用t检验，组间比较通过单向方差分析，如果方差是均质的，则使用LSD-t检验，如果方差不是均质的，则使用Tamhane's T2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。应用GraphPad Prism 7软件及Image J软件作图。

2 结果

2.1 异丙酚处理来源外泌体的分离、提取和鉴定 分离外泌体并通过透射电子显微镜镜、纳米颗粒示踪分析和表面标志物等进行表征，透射电子显微镜下可见多个粒径范围30～150 nm的双层膜状囊泡。纳米颗粒跟踪分析仪（NTA)结果：NC组（对照组）外泌体浓度为1.85×109particles/mL，粒径约127 nm；P组(异丙酚处理组)外泌体浓度为2.54×1010particles/mL，粒径约97 nm；DMSO组（溶剂对照组）外泌体浓度为1.1×1010particles/mL，粒径约129 nm，异丙酚处理组外泌体浓度明显高于另外两组，说明异丙酚可促进外泌体的释放，增加外泌体浓度。外泌体蛋白WB结果：CD63、CD9、TSG101等外泌体表面标志物有表达，只在细胞内表达的内质网分子伴侣Grp94不表达。异丙酚处理组无论是在细胞还是外泌体，表面标志物CD63、CD9及TSG101的表达均增加，其中细胞中TSG101表达的增加不明显。GAPDH为内参蛋白，见图1。

图1 异丙酚处理来源的外泌体

2.2 建立心肌细胞损伤模型 具体建立体外心肌细胞损伤模型如方法中所述，H2O2被证实可用于模拟IRI产生的氧化应激，高浓度的H2O2（500 μmol/L）可诱导H9C2心肌细胞的坏死性凋亡。CCK8检测结果显示：与NC组相比，H2O2500 μmol/L处理后，心肌细胞活性显著降低，尤其是处理2 h后（P＜0.000 1，100.0%±0.0% vs 31.64%±1.384%, N=3）。显微镜下可见NC组心肌细胞边界清晰，排列有序，贴壁生长。H2O2500 μmol/L处理2 h后，心肌细胞形态变得不规则，边界不清；电镜下可见H2O2500 μmol/L处理2 h后细胞损伤，内质网肿胀，线粒体水肿变圆。故选用500 μmol/L浓度H2O2处理H9C2心肌细胞2 h的建模方法进行后续实验，见图2。

图2 细胞活性、形态及超微结构的变化

2.3 外泌体的摄取内化及产生保护作用最适外泌体浓度 激光共聚焦显微镜下可见：细胞核染蓝色荧光，外泌体染绿色荧光，将不同分组来源的外泌体与心肌细胞共培养12 h和24 h后，绿色荧光的外泌体被心肌细胞摄取内化，聚集在细胞核周围，但是荧光强度显示共培养12 h和24 h对外泌体的摄入没有明显影响。用BCA蛋白浓度检测法对外泌体蛋白浓度进行统一定量处理，配平为1 μg/μL。CCK8结果：与H2O2处理组相比，10 μg/100 μL（P=0.028,45.81%±1.751% vs 63.68%±5.003%, N=3）、15 μg/100 μL（P=0.000 5, 45.81%±1.751%vs 81.08%±2.996%，N=3）及20 μg/100 μL(P=0.001 5，45.81%±1.751% vs 74.30%±3.204%, N=3)浓度的外泌体加入后均产生保护作用，心肌细胞活性恢复，其中15 μg/100 μL浓度外泌体保护作用最强，见图3。

图3 外泌体的摄取内化及保护作用

2.4 H2O2处理H9C2心肌细胞发生坏死性凋亡 WB结果显示：与NC组相比，H2O2500 μmol/L处理2、6、12 h后，坏死性凋亡相关蛋白受体相互作用蛋白（RIP）1和RIP3升高，处理2 h时升高最显著（P=0.035 4，0.806 3±0.115 2 vs 1.498±0.189 2, N=3；P=0.000 5,0.639 3±0.017 40 vs 1.119±0.042 52, N=3）；为了进一步验证坏死性凋亡模型，单独用H2O2500 μmol/L处理H9C2心肌细胞2 h，WB结果显示：与NC组相比，H2O2500 μmol/L处理2 h后，坏死性凋亡相关蛋白RIP1（P=0.018 2,0.331 3±0.056 19 vs 0.773 0±0.099 86, N=3）、RIP3（P=0.023 6,0.486 0±0.058 32 vs 0.856 0±0.086 02, N=3）、mLKL（P=0.006 2,0.696 3±0.018 77 vs 1.232±0.099 91, N=3）和膜蛋白p-mLKL（P=0.000 8,0.734 7±0.119 7 vs 2.408±0.140 2, N=3）显著上调。GAPDH为细胞内的内参蛋白，beta-tubuLin为细胞膜中的内参蛋白。qRT-PCR 结果显示：与NC组相比，H2O2500 μmol/L处理2 h后，坏死性凋亡相关蛋白RIP1（P=0.041 6,1.000±0.0 vs 5.183±0.880 5, N=2）、RIP3（P=0.022 3,1.000±0.0 vs 5.697±0.712 5,N=2）和混合普系激酶结构域蛋白（mLKL）（P=0.001 6,1.000±0.0 vs 2.490±0.059 00, N=2）显著上调。这表明500 μmol/L浓度H2O2处理2 h的H9C2心肌细胞引起坏死性凋亡，见图4。

图4 WB和qRT-PCR检测坏死性凋亡相关蛋白RIP1和RIP3的表达变化

2.5 异丙酚处理来源的外泌体通过抑制坏死性凋亡对损伤心肌细胞产生保护作用 AnnexinV-FITC/PI试剂盒对不同处理的H9C2心肌细胞进行染色，使用流式细胞仪检测细胞坏死性凋亡数目，Q1区域为许可范围内的检测误差，Q2区域为坏死性凋亡细胞，Q3区域为正常活细胞，Q4区域为早期凋亡细胞。结果示：与NC组相比，H2O2500 μmol/L 处理2 h后，坏死性凋亡细胞数显著增多 （P=0.003，1.550%±0.150 0% vs 8.450%±0.350 0%, N=2），加入异丙酚来源外泌体（p-exo）后，坏死性凋亡细胞数减（P=0.004 9,8.450%±0.350 0% vs 3.050%±0.150 0%, N=2）；与H2O2处理组相比，加入p-exo后，CCK8检测的细胞损伤减少（P=0.000 2,71.85%±1.936% vs 96.08%±0.174 6%,N=3）；WB结果也显示坏死性凋亡相关蛋白RIP1（P=0.019,1.624±0.184 1 vs 0.607 3±0.131 7, N=3)、RIP3（P=0.002 7,1.866±0.168 6 vs 0.631 3±0.079 43,N=3)、mLKL（P=0.006 2，1.543±0.177 4 vs 0.508 7±0.083 01, N=3）和膜蛋白p-mLKL（P=0.019 4，1.487±0.151 2 vs 0.705 0±0.140 9, N=3）下调，对照组nc-exo和d-exo的变化没有统计学意义，见图5。

图5 异丙酚处理来源的外泌体抑制坏死性凋亡对损伤心肌细胞产生保护作用

3 讨论

外泌体是一类可在细胞间进行传递的囊泡状物质，其包含的生物学成分十分复杂，主要为蛋白质、RNA及脂质等[5-6]。Huang P等[7]研究报道，阿托伐他汀预处理间充质干细胞，然后从细胞上清中提取外泌体，加入大鼠IRI模型后梗死面积减少，心肌功能得到改善。这表明外泌体装载药物并将有效成分传递给靶细胞及靶器官发挥生物学作用的可行性。课题组前期研究结果表示异丙酚有抗氧化作用，可对抗机体氧化应激损伤，对心肌细胞IR损伤产生保护作用。与单独异丙酚药物处理相比，来自于外泌体装载的异丙酚药物处理具有以下优势：外泌体由脂质双层膜包裹，性质稳定，能够保证药物在体液运输中不被降解，提高药物的生物利用度[8]。外泌体双层膜表面携带大量蛋白分子，可通过信号转导定向作用于靶细胞[9]。外泌体粒径小，通透性强，几乎存在所有体液中，能更有效地穿透人体生物屏障。本实验采用异丙酚处理 HUVECS，然后超高速离心提取p-exo，差速超高速离心法提取的外泌体杂质少，浓度高且双层膜结构完整，可满足后续实验要求。透射电子显微镜、纳米颗粒示踪分析及外泌体表面标志物检测是鉴定外泌体的重要方法。透射电子显微镜对外泌体的形态及大小进行可视化观测，可见多个大小在30～150 nm范围的双层膜状囊泡；同时采用 NTA 对外泌体的布朗运动进行追踪和分析，计算出粒度分布和浓度。对照组外泌体浓度为1.85×109particles/mL，粒径约127 nm；异丙酚处理组外泌体浓度为 2.54×1010particles/mL，粒径约97 nm；DMSO溶剂对照组外泌体浓度为1.1×1010particles/mL，粒径约129 nm，研究发现与单纯HUVECS来源外泌体组和DMSO溶剂处理来源外泌体组比较，加入异丙酚处理后来源外泌体的释放浓度增加，说明异丙酚对 HUVECS 分泌外泌体有促进作用。CD63、CD9及TSG101是目前鉴定外泌体的主要表面标志蛋白，WB结果可见CD63、CD9、TSG101等外泌体表面标志物有表达，只在细胞内表达的内质网分子伴侣 Grp94不表达，GAPDH为内参蛋白。PKH67是目前最常用的外泌体染色试剂，将染色的外泌体与H9C2心肌细胞共培养，在激光共聚焦显微镜下观察外泌体被染色为绿色荧光，细胞核被DAPI染色为蓝色荧光，绿色荧光聚集在蓝色荧光周围，说明外泌体能够被摄取内化进入H9C2心肌细胞中，进而发挥生物学作用。

H2O2是一类具有极强氧化作用的物质，是引起细胞死亡的主要活性氧，其介导的细胞损伤与心肌缺血再灌注损伤的发病机制相关。故采用H2O2不同浓度处理H9C2心肌细胞，模拟细胞内缺血再灌注时的氧化应激损伤，制备损伤模型。CCK8检测结果显示：与NC组（对照组）相比，经H2O2500 μmol/L处理后，心肌细胞活性显著降低，尤其是处理2 h后。显微镜下可见 NC组心肌细胞边界清晰，排列有序，贴壁生长。经H2O2500 μmol/L处理 后，心肌细胞形态变得不规则，边界不清；电镜下可见H2O2500 μmol/L处理2 h后细胞损伤，内质网肿胀，线粒体水肿变圆。文献报道高浓度的H2O2（500 μmol/L）可诱导H9C2心肌细胞的坏死性凋亡[10]，故选用500 μmol/L浓度的H2O2处理细胞2 h的建模方式进行后续实验。将p-exo加入H9C2心肌细胞 IR 模型中，观察其对体外H9C2心肌细胞 IR 氧化应激损伤的作用；CCK8 是反应细胞损伤最直观和便利的指标，结果示p-exo可显著减少IR心肌细胞的损伤。AnnexinVFITC/PI细胞染色是检测细胞死亡的有效方法，PI是一种胞核核酸染料，不能穿过正常细胞的完整胞膜，当细胞发生坏死性凋亡时，胞膜被破坏，PI对其胞核进行染色，流式细胞仪可定向识别被染色的坏死细胞并进行计数，将正常细胞与坏死性凋亡细胞区分开来，结果显示p-exo可显著减少IR模型H9C2心肌细胞的坏死性凋亡的发生。

坏死性凋亡是新的程序性细胞死亡方式，是一种受到高度调控的细胞坏死[11-12]，主要由RIP1和RIP3介导，与mLKL形成复合体，激活磷酸化mLKL并由细胞质转移至细胞膜上，在膜结构上形成通透孔道，破坏膜完整性，引起细胞死亡[13-14]。RIP1、RIP3及mLKL均为坏死性凋亡的重要调控蛋白。mLKL是坏死性凋亡的最终执行蛋白，mLKL磷酸化是机体发生坏死性凋亡的必要条件。坏死性凋亡参与了多种疾病的病理生理过程，Zhang T等[15]发现，IR或氧化应激可以通过RIP3依赖性信号传导途径导致心肌坏死性凋亡。因此在建立IRI坏死性凋亡模型时，不仅要检测IRI细胞内坏死性凋亡相关蛋白RIP1、RIP3及mLKL的表达变化，还要提取损伤细胞的胞膜蛋白，检测其中p-mLKL蛋白的水平变化。本次实验在验证p-exo能明显减轻H9C2心肌细胞IR损伤的基础上，进一步研究p-exo在心肌细胞坏死性凋亡中可能发挥的作用，结果显示：H2O2500 μmol/L处理H9C2心肌细胞2 h后，流式细胞学结果显示：Q3区域坏死性凋亡细胞数显著增多，WB检测坏死性凋亡相关蛋白RIP1、RIP3、mLKL和膜蛋白p-mLKL显著上调，qRT-PCR结果显示：坏死性凋亡相关蛋白RIP1和mLKL的mRNA显著上调；在加入p-exo 150 μg/mL浓度后,CCK8 检测的细胞损伤减少，流式细胞学示坏死性凋亡细胞数减少，WB结果显示：坏死性凋亡相关蛋白RIP1、RIP3、mLKL和膜蛋白p-mLKL上调受到抑制。结果表明，p-exo能够抑制IR损伤导致的H9C2心肌细胞坏死性凋亡，对心肌产生保护作用。p-exo减少H9C2心肌细胞死亡的过程与降低心肌细胞中RIP1、RIP3及mLKL的活力，同时，抑制p-mLKL的表达及向胞膜转移相关。

本研究发现p-exo对H9C2心肌细胞IR氧化应激损伤具有保护作用，并证明是通过下调IR心肌细胞中坏死性凋亡相关蛋白RIP1、RIP3及mLKL的表达，抑制p-mLKL迁移至膜上，避免破坏胞膜完整性，从而减少细胞死亡。但外泌体传递的具体有效生物活性物质仍未明确，其产生作用的具体信号通路仍需进一步探索研究。本次研究探讨了外泌体作为异丙酚这个药物的载体，不仅可以将有效信息传递至心肌细胞产生保护作用，还阐明了具体的保护方式，将延展异丙酚保护缺血再灌注损伤心肌细胞的新方向，为临床防治心肌缺血再灌注损伤的外泌体药物治疗提供理论依据和研究基础，开拓未来外泌体治疗的新领域。