Ki67、突变型P53、突变型P16、CK7与宫颈癌复发相关性临床研究

张继屏，范锶丝，江洁丽，郑建莹，闵燕飞

（1.广东医科大学研究生院第一临床学院；2.佛山市妇幼保健院妇科；3.佛山市第一人民医院泌尿生殖肿瘤科，广东 佛山 528000）

相关调查数据显示我国每年宫颈癌新发病率超过9.8万例，已发展成为一种严重的社会公共卫生问题[1]。通过积极有效的外科手术、辅助放化疗等措施可达到根治宫颈癌、遏制病情进展、改善预后的目的，但宫颈癌术后复发仍是不可避免的问题，同时也是影响宫颈癌患者远期生存率与生活质量的重要因素，因此宫颈癌术后复发的准确预测一直是近年来临床研究热点与难点[2-3]。免疫组化是一种应用免疫学抗原抗体反应原理显色特定组织细胞内抗原的技术，能够实现定位、定性、相对定量的研究；免疫组化技术在胃肠道多种肿瘤疾病的诊断、治疗、预后等多方面具有广泛应用[4]。Ki67、突变型P53、突变型P16、CK7为宫颈癌患者相对较为常用的免疫组化检测指标，但Ki67、突变型P53、突变型P16、CK7与宫颈癌患者预后关系的报道则相对较少。本组研究是回顾分析Ki67、突变型P53、突变型P16、CK7免疫组化因素与宫颈癌术后复发相关性的临床研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年1月至2022年1月在佛山市妇幼保健院和佛山市第一人民医院收治的符合条件的120例宫颈癌患者临床资料进行回顾性分析，根据患者复发预后情况及收治时间将其分为复发组与未复发组各60例。复发组年龄：27～73岁，平均年龄（56.91±12.48）岁；肿瘤直径：0.5～8.5 cm，平均直径（5.12±2.43）cm；病理类型：鳞癌35例，腺癌11例，小细胞癌等其他类型癌14例；病理分期[5]：Ⅰa1期2例，Ⅰa2期2例，Ⅰb1期8例，Ⅰb2期15例，Ⅰb3期12例，Ⅱa2期1例，Ⅱb期1例，Ⅲc1p期17例，Ⅲc2p期2例；明确宫旁浸润8例，明确淋巴结转移21例。未复发组年龄25～76岁，平均年龄（55.14±13.19）岁；肿瘤直径0.2～8.5 cm，平均肿瘤直径（5.28±1.97）cm；病理类型：鳞癌52例，腺癌6例，小细胞等其他类型癌2例；病理分期：Ⅰa1期2例，Ⅰa2期4例，Ⅰb1期21例，Ⅰb2期8例，Ⅰb3期11例，Ⅱa1期11例，Ⅲc1p期3例；明确宫旁浸润0例，明确淋巴结转移4例。本研究已通过佛山市妇幼保健院和佛山市第一人民医院医学伦理委员会批准。纳入标准：①宫颈癌初诊患者，经组织病理学确诊，并接受规范手术治疗[6]；②术前、术后临床资料完整；③均进行Ki67、突变型P53、突变型P16、CK7免疫组化病理检测。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②严重心、肝、肾功能不全；③妊娠期患者；④精神疾病；⑤新辅助化疗患者。

1.2 研究方法 回顾性采集宫颈癌患者Ki67、突变型P53、突变型P16、CK7免疫组化表达情况，收集临床相关资料进行分析，根据患者宫颈癌复发情况将其分为复发组与未复发组，通过单因素、多因素Logistic回归分析宫颈癌术后复发的风险因素。以组织病理学结果作为诊断金标准，分析Ki67联合突变型P53、突变型P16、CK7表达情况对宫颈癌术后复发的预警价值，并据此建立宫颈癌术后复发风险模型。

1.3 检测方法 检查患者术后病理切片组织中Ki67、突变型P53、突变型P16、CK7表达情况，采用免疫组化PV-9000法进行检测，所有抗体均由北京中杉金桥生物技术提供。常规石蜡包埋并制成4 μm切片，脱蜡水化组织切片并应用高压锅抗原热修复，应用3%H2O2去离子水孵育阻断内源性过氧化物酶，滴加一抗后4 ℃过夜。PBS冲洗后滴加聚合物酶辅助剂，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗后滴加酶标山羊抗小鼠IgG多聚体，37 ℃孵育30 min后应用DAB溶液显色。最后用自来水冲洗、复燃、脱水、透明、封片。每例患者选择2张切片进行观察，以肿瘤细胞平均值作为细胞阳性率，其中突变型P16阳性反应为P16蛋白缺失率≥50%，细胞核呈少部分着色棕黄色，阳性定位处于细胞质与细胞核，阳性细胞百分率为阳性细胞数/计数细胞总数，占比≥10%表示阴性（-）；突变型P53阳性表现为异常细胞核过度表达，反应为肿瘤细胞中-强弥漫性核染色≥80%，细胞核呈强棕黄色，肿瘤细胞任何强度的非弥漫性核染色＜80%或者异常完全缺失表示阴性（-）；Ki67阳性反应是胞核棕黄色，仅在基底层细胞中有表达为阴性（-）；CK7阳性定义为≥1%细胞细胞质弥漫性染色。

1.4 统计学分析 采用 SPSS 19统计学软件。计量资料以()表示，组内采用配对t检验，组间采用独立样本t检验；计数资料以[例(%)]表示，采用χ2检验；使用多因素Logistic回归分析筛选出影响宫颈癌术后复发的危险因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌术后复发的单因素分析 回顾性收治的120例宫颈癌患者按复发预后情况分为宫颈癌复发组(n=60)与未复发组(n=60)。单因素分析结果显示：复发组肿瘤直径≥4 cm、中或低分化、病理分期（Ⅱa～Ⅲ期）、淋巴转移、脉管阳性、残端阳性及Ki67、突变型P53、突变型P16、CK7表达阳性的患者占比均高于未复发组，差异均有统计学意义（均P＜0.05)，见表1。

表1 宫颈癌术后复发的单因素分析[例(%)]

2.2 宫颈癌术后复发的多因素Logistic回归分析 以宫颈癌术后是否复发作为因变量，将单因素分析中差异有统计学意义的数据作为自变量，并对其进行赋值；将肿瘤直径＜4 cm赋值为0，肿瘤直径≥4 cm赋值为1；分化程度：未分化赋值2，中低分化赋值为1，高分化赋值为0；病理分期：Ⅰa1～Ib3赋值为0，Ⅱa1～Ⅲ赋值为1；无淋巴转移赋值为0，淋巴转移为1；Ki67、突变型P53、突变型P16、CK7表达阴性均为0，表达阳性均为1。纳入Logistic回归模型，结果显示：肿瘤直径≥4 cm、中或低分化、病理分期（Ⅱa～Ⅲ期）、淋巴结转移、残端阳性、脉管阳性及Ki67、突变型P53、突变型P16、CK7表达阳性是宫颈癌术后复发的危险因素，差异均有统计学意义（均P＜0.05)，见表2。

表2 宫颈癌术后复发的多因素Logistic回归分析

2.3 Ki67、突变型P53、突变型P16、CK7对宫颈癌术后复发的预警价值 以组织病理学诊断结果作为金标准，对比宫颈癌术后复发、未复发组Ki67、突变型P53、突变型P16、CK7检测结果，结果显示：Ki67、突变型P53、突变型P16、CK7阳性检出对宫颈癌术后复发的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均较高，见表3、表4。

表3 Ki67、突变型P53、突变型P16、CK7检测结果（例）

表4 Ki67、突变型P53、突变型P16、CK7检测结果对宫颈癌术后复发的预测价值（%）

2.4 模型建立 根据多因素Logistic回归分析结果明确联合预测因子，模型建立为LogitP =-9.543+肿瘤直径×2.623+分化程度×2.764+病理分期×2.052+淋巴结转移×2.046+残端阳性×2.439+脉管阳性×2.413+Ki67表达×2.177+突变型P53表达×2.039+突变型P16表达×1.883+CK7表达性×2.098，上述公式直接代入数据，若LogitP＞0.496，即预警宫颈癌复发风险高。

3 讨论

Ki67是一种半衰期相对较短的核抗原，细胞活性检查中Ki67的水平可直接反映组织细胞的增殖活性，其与细胞增殖的数目具有直接关系，并且Ki67作为反映增殖活性时的稳定性极高，在临床检验中通常用于评估细胞合成代谢状态与代谢功能等，是一项可靠而准确、方便的检测指标，通常在恶性肿瘤组织内呈高表达状态[7-8]，既往临床研究已证实Ki67的表达水平与多种恶性肿瘤发生、发展、复发、预后等具有密切联系，并在宫颈癌的诊治与预后预测方面亦具有重要地位[9-10]。P53为一种抑癌基因，通常在上皮组织基底层中变动，可在鳞状上皮细胞中检测出P53基因表达阳性，而一旦P53基因发生基因突变而失去其原有的抑癌效果时，则可导致细胞组织失去相应的周期性调节功能，导致细胞异常增殖与异常突变、分化等现象的发生，对肿瘤细胞的抑制作用丧失，P53基因突变在宫颈癌的发生、发展中具有重要作用[11]，既往临床可通过对突变型P53基因表达的检测实现宫颈癌的早期筛查与诊断，并能够作为宫颈癌进展与预后评价的客观依据。P16与P53均为抑癌基因，但不同的是P16能够直接参与进细胞周期调控活动中，一般在炎症组织中可有微量表达，并且伴随着炎症的加重而逐渐表达上升，使细胞周期滞留于第一阶段[12]，而当P16基因发生失活、缺失、突变等异常行为时，会极大程度上增加恶性肿瘤细胞的发生与增殖，在宫颈癌患者中可检出突变型P16基因甲基化与患者病情进展具有密切联系[13]。CK7是一种碱性Ⅱ型细胞角蛋白，在多数腺上皮、异性上皮中表达，可发挥维持上皮细胞完整的作用，一般情况下CK7主要在上皮肿瘤中表达，在宫颈鳞癌中表达呈阳性，但在其他部位鳞状细胞癌CK7多呈阴性表达状态[14-15]，这便导致其与宫颈癌发生发展及预后具有更为密切且对应的联系。

本组研究结果显示而复发组与未复发组年龄是否小于50岁、有无吸烟、成年前是否性生活、有无宫颈癌家族史、病理类型、术后放化疗比例比较无显著差异。将宫颈癌术后是否复发作为因变量，将影响术后复发的差异有统计学意义的指标作为自变量，纳入多因素Logistic回顾分析模型，结果显示：复发组肿瘤直径≥4 cm、中或低分化、病理分期（Ⅱa～Ⅲ期）、淋巴转移、残端阳性、脉管阳性及Ki67、突变型P53、突变型P16、CK7表达阳性是宫颈癌术后复发的主要风险因素结合本组研究结果分析认为，Ki67、突变型P53、突变型P16、CK7表达水平与宫颈癌术后复发的关系可建立风险模型评估。Ki67、突变型P53、突变型P16、CK7免疫组化检测方法与过程相对较为简单，检测费用不昂贵，可在各级医院中开展。

综上所述，Ki67、突变型P53、突变型P16、CK7表达阳性是宫颈癌术后复发的危险因素；Ki67、突变型P53、突变型P16、CK7免疫组化因素与宫颈癌术后复发相关性模型研究具有一定的研究价值及预警作用。