樱花素对脊髓损伤后小胶质细胞介导的神经炎症的影响

摘要：目的" 探讨樱花素对脊髓损伤（SCI）小鼠运动功能的作用及相关机制。方法" 将54只C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、SCI组和樱花素组，假手术组小鼠仅行T9椎板切除术，而SCI组及樱花素组小鼠于T9椎节处进行脊髓撞击损伤，在术后的不同时间对各组小鼠进行行为学检测以评估各组小鼠运动能力。采用组织病理学评估各组小鼠SCI程度，通过基因本体和京都基因与基因组百科全书富集分析预测樱花素在SCI中的作用和机制，采用逆转录实时荧光定量PCR、ELISA和免疫荧光检测SCI小鼠体内炎症水平和小胶质细胞活化情况。体外利用脂多糖诱导BV2细胞活化并给予樱花素进行干预，分为对照组、脂多糖组和樱花素组，进一步评估樱花素干预对BV2细胞炎症因子释放和BV2细胞活化情况。采用磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路激活剂［胰岛素样生长因子-1（IGF-1）］体外干预樱花素诱导的BV2细胞（樱花素+IGF-1组），采用樱花素体外干预IGF-1诱导的BV2细胞（IGF-1+樱花素组），Western blot进行分子机制验证。结果" 行为学检测及组织学染色结果显示，与SCI组相比，樱花素组小鼠表现出更强的运动能力，且脊髓组织损伤面积明显减少（P均lt;0.001）。基因本体富集分析显示，樱花素可能参与SCI后的炎症过程，京都基因与基因组百科全书富集分析显示，樱花素可能调控PI3K/Akt通路发挥其神经保护作用。体内外实验结果显示，樱花素显著抑制肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-1β等炎症因子水平以及小胶质细胞的活化数量（P均lt;0.05）。Western blot结果显示，樱花素显著降低PI3K及Akt磷酸化水平（P均lt;0.001）且抑制IGF-1引起的PI3K及Akt磷酸化水平的提高（P均lt;0.001），而IGF-1的干预作用与之相反（P=0.001，Plt;0.001）。逆转录实时荧光定量PCR、ELISA及免疫荧光结果显示，樱花素+IGF-1组炎症因子水平和小胶质细胞活化数量较樱花素组均显著增加（P均lt;0.05）。结论" 樱花素可能通过抑制PI3K/Akt通路的激活抑制SCI后小胶质细胞介导的炎症反应，改善脊髓组织病理损伤并促进SCI小鼠运动功能的恢复。

关键词：脊髓损伤；樱花素；小胶质细胞；炎症；磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B

中图分类号： R285.5" 文献标识码： A" 文章编号：1000-503X（2024）06-0836-13

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.16087

基金项目：国家自然科学基金面上项目（82071360）、蚌埠医学院第一附属医院高水平科技创新团队（BYYFY2022TD002）和安徽省高等学校重点科学研究项目（2023AH040289）

Effect of Sakuranetin on Microglia-Mediated Neuroinflammation After Spinal Cord Injury

XIAO Linyu1，2，CHEN Yue1，2，DUAN Ting2，3，SUN Yang1，2，XU Yibo2，4，ZHAO Yajing2，SONG Xue2，5，YAN Xingzhou1， HU Jianguo2，6

1Department of Rehabilitation，2Anhui Province Key Laboratory of Basic and Translational Research of Inflammation-Related Diseases，3Department of Emergency Medicine，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University，Bengbu，Anhui 233004，China

4Department of Histology and Embryology，College of Basic Medical Sciences，Bengbu Medical University，Bengbu，Anhui 233030，China

5Central Laboratory，6Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University，Bengbu，Anhui 233004，China

Corresponding author：HU Jianguo" Tel：0552-3086013，E-mail：jghu9200@bbmc.edu.cn

ABSTRACT：Objective" To investigate the effects of sakuranetin （SK） on motor functions in the mouse model of spinal cord injury （SCI） and decipher the mechanism.Methods" Fifty-four C57BL/6J mice were randomized into sham，SCI，and SK groups.The mice in the sham group underwent only laminectomy at T9，while those in the SCI and SK groups were subjected to spinal cord contusion injury at T9.Behavioral tests were conducted at different time points after surgery to evaluate the motor functions of mice in each group.The pathological changes in the tissue were observed to assess the extent of SCI in each group.The role and mechanism of SK in SCI were predicted by gene ontology （GO） and Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） enrichment analyses.Reverse transcription real-time fluorescence quantitative PCR，ELISA，and immunofluorescence were employed to evaluate the inflammation and activation of microglia in SCI mice.BV2 cells in vitro were classified into control （Con），lipopolysaccharide （LPS），and LPS+SK groups.The effects of SK intervention on the release of inflammatory cytokines and the activation of BV2 cells were evaluated.Furthermore，the phosphatidylinositol-3-kinase（PI3K）/protein kinase B （AKT） signaling pathway activator insulin-like growth factor-1 （IGF-1） was used to treat the SK-induced BV2 cells in vitro （SK+IGF-1 group），and SK was used to treat the IGF-1-induced BV2 cells in vitro （IGF-1+SK group）.Western blotting was conducted for molecular mechanism validation.Results" Behavioral tests and histological staining results showed that compared with the SCI group，the SK group exhibited improved motor abilities and reduced area of damage in the spinal cord tissue （all Plt;0.001）.The GO enrichment analysis predicted that SK may be involved in the inflammation following SCI.The KEGG enrichment analysis predicted that SK regulated the PI3K/Akt pathway to exert the neuroprotective effect.The results from in vitro and in vivo experiments showed that SK lowered the levels of tumor necrosis factor-α，interleukin-6，and interleukin-1β and inhibited the activation of microglia （all Plt;0.05）.The results of Western blotting showed that SK down-regulated the phosphorylation levels of PI3K and Akt （all Plt;0.001） and inhibited the IGF-1-induced elevation of PI3K and Akt phosphorylation levels （all Plt;0.001）.Conversely，IGF-1 had the opposite effects （P=0.001，Plt;0.001）.The results of reverse transcription real-time fluorescence quantitative PCR，ELISA，and immunofluorescence showed that the SK+IGF-1 group had higher levels of inflammatory cytokines and more activated microglia than the SK group（all Plt;0.05）.Conclusion" SK may suppress the activation of the PI3K/Akt pathway to inhibit the inflammation mediated by SCI-induced activation of microglia，ameliorate the pathological damage of the spinal cord tissue，and promote the recovery of motor functions in SCI mice.

Key words：spinal cord injury；sakuranetin；microglia；inflammation；phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B

Acta Acad Med Sin，2024，46（6）：836-848

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种常见的中枢神经系统疾病，表现为损伤平面以下感觉、运动和自主神经功能障碍等［1］。由于SCI不可逆且治疗周期长，治疗SCI已成为当今医学界面临的重大难题，亟待解决［2］。炎症反应在SCI的发病机制中发挥关键作用，是继发性SCI的主要病理过程，同时也是导致SCI患者神经功能损伤的重要因素［3］。SCI后小胶质细胞是引发炎症的主要细胞类型，该细胞的活化加剧了炎症反应［4］。因此，控制小胶质细胞活化介导的促炎反应可以减少SCI后的继发性损害和功能障碍。目前用于治疗SCI炎症的药物有限，仅有甲基强的松龙经美国食品药品监督管理局批准用于临床治疗［5］。然而，甲基强的松龙的治疗窗口狭窄且存在诸多不良反应，因此，寻找更安全有效的SCI治疗药物成为当前SCI治疗的主要目标［6］。樱花素是一种从樱桃树皮中提取的天然甲氧基类黄酮化合物，具有抗炎、抗氧化、神经保护等多种药理作用［7-8］。有研究表明樱花素通过抑制肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素（interleukin，IL）-6的表达改善小鼠的过敏性哮喘和阿尔茨海默病［9-10］。然而，关于樱花素在SCI中的作用报道较少。本研究旨在探讨樱花素在小鼠SCI后运动功能恢复中的作用及其分子机制，以期为SCI的治疗提供理论依据。

1" 材料和方法

1.1nbsp; 实验动物与分组

采用SPF级6～8周龄C57BL/6J雌性小鼠54只（购于江苏集萃药康生物科技股份有限公司），体重18～22 g。小鼠饲养于恒温动物房内，明暗12 h交替，自由获取食物和水。适应性喂养1周后将小鼠随机分为假手术组、SCI组和樱花素组，每组18只。本研究经蚌埠医科大学动物研究伦理委员会批准（伦理审查编号：伦动科批字〔2022〕第068号）。

1.2" 主要试剂

樱花素（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%）；HE、劳克坚牢蓝染液、甲苯胺蓝染液、CCK-8试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；Trizol（美国Thermo Fisher公司）；cDNA试剂盒、PCR反应试剂盒（北京Takara公司）；引物TNF-α、IL-6、IL-1β、β-actin（上海生工生物工程股份有限公司）；抗体CD11b（武汉塞维尔生物科技有限公司），CD68、胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）、山羊抗小鼠IgG Hamp;L、山羊抗兔IgG Hamp;L（英国Abcam公司），磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化PI3K（phosphorylation PI3K，p-PI3K）、磷酸化Akt（phosphorylation Akt，p-Akt）、GAPDH（武汉三鹰生物技术有限公司）；小鼠小胶质细胞株BV2（武汉普诺赛生物科技有限公司）；脂多糖（美国Sigma公司）；MEM培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；酶联免疫吸附实验检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），BCA蛋白试剂盒（英国Abcam公司）。

1.3" SCI造模及分组

术前24 h禁食、8 h禁水。小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，以T9脊椎节段为中心消毒备皮，麻醉后在该节段处剔除椎板，使用脊髓打击器IH-0400以50 kdynes的撞击力度撞击暴露的脊髓，构建小鼠T9节段撞击挫伤型模型。撞击后脊髓局部瞬间瘀血，小鼠出现甩尾和下肢痉挛代表SCI模型构建成功［11］。假手术组则不做脊髓撞击。造模后隔离饲养，樱花素组给予樱花素（DMSO溶解，生理盐水配制，20 mg/kg［9，12］）每日灌胃处理（0.2 mL），SCI组、假手术组分别给予等剂量生理盐水灌胃，持续至小鼠取材前1 d。

1.4" 巴索小鼠量表评分

造模成功后，参照既往研究［13］，于术前和术后第1、3、7、14、21、28天对各组随机选取的6只小鼠进行巴索小鼠量表（Basso mouse scale，BMS）评分。评分时采取双盲实验，评分范围为0～9分（踝关节无运动至功能完全恢复）。

1.5" 斜板实验

于术前和术后第1、3、7、14、21、28天将随机选取的6只小鼠置于垫有橡胶垫的斜板上，小鼠身体纵轴与斜板纵轴平行放置，小鼠头朝斜板抬高侧。从0°开始，每次抬高5°，观察小鼠能在斜板上停留5 s而不掉落的最大角度（设斜板最高角度为60°），每只小鼠检测3次，取其平均值作为测定值。

1.6" 游泳实验［14］

术后第7、14、21、28天，随机选取的6只小鼠采用路易斯维尔游泳量表［15］在4 min内观察小鼠从玻璃缸一端游向另一端的游泳表现，根据其前肢依赖程度、后肢运动情况以及身体位置，进行0～17的评分。采取双盲实验，取平均值作为其得分。

1.7" 脚印分析［16-17］

术后第28天，将随机选取的6只小鼠的前爪和后爪分别涂上红色和蓝色染料，让其在覆有长80 cm、宽4 cm的白纸的窄暗道上行走，记录小鼠行走时留下的足印并分析。每只小鼠重复行走3次，取其行走印迹为直线且清晰的一次为其代表性图片，并对其脚印进行评分。评分标准：0分：持续的足背跛行或后肢拖沓，不能够走出可见的脚印；1分：在3个脚印中有至少3个足趾出现可见的足趾印；2分：内旋或外旋角度超过基线值的两倍；3分：没有明显的足趾拖沓，仅有内旋或外旋；4分：没有明显的内旋或外旋（不超过基线角度的2倍）［18］。

1.8" 组织学评估

术后第28天，将各组小鼠行腹腔麻醉，0.01 mol/L的PBS和4%多聚甲醛经左心室快速灌注固定，距损伤中心前后0.5 cm截取脊髓组织。4%多聚甲醛固定12 h，脱水后最佳切割温度化合物包埋，制备5 μm厚的冰冻切片，进行HE、劳克坚牢蓝以及尼氏染色，并使用40倍显微镜进行观察。采用Image J处理图像，选择SCI小鼠SCI中心同一截点处切片，评估SCI小鼠脊髓相对损伤面积、相对髓鞘化面积以及脊髓前角运动神经元残留数量。相对损伤面积（%）=（损伤面积/脊髓面积）×100%；相对髓鞘化面积（%）=（髓鞘化面积/脊髓面积）×100%。

1.9" 细胞培养及处理

BV2细胞培养于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的MEM培养基中，在37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育。将细胞分为对照组、脂多糖组、脂多糖+樱花素组、脂多糖+IGF-1组、脂多糖+樱花素+IGF-1组以及脂多糖+IGF-1+樱花素组。樱花素溶于DMSO，生理盐水稀释为不同浓度（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L）。脂多糖组为在BV2培养基中加入1 μg/mL的脂多糖模拟炎症反应［19］，脂多糖+樱花素组为脂多糖（1 μg/mL）诱导6 h后给予最佳樱花素抗损伤浓度（50 μmol/L）同时进行干预24 h，而不做处理的细胞为对照组。分子机制实验中，脂多糖+IGF-1组为脂多糖（1 μg/mL）诱导6 h后给予IGF-1（3 nmol/L）同时进行干预24 h［20-21］；脂多糖+樱花素+IGF-1组为于脂多糖+樱花素组加入IGF-1（3 nmol/L）同时进行干预24 h；脂多糖+IGF-1+樱花素组为于脂多糖+IGF-1组加入樱花素（50 μmol/L）同时进行干预24 h。

1.10" CCK-8实验

将BV2细胞（1×104个/孔）接种于96孔板中，每组5个复孔。待细胞密度达80%左右加入不同浓度樱花素处理24 h，加或不加脂多糖（1 μg/mL）处理6 h。每孔加入10 μL的CCK-8工作液后37 ℃、5% CO2培养箱中避光孵育1 h，使用酶标仪在450 nm处检测吸光度值。

1.11" 樱花素治疗SCI相关靶点基因的筛选

通过PubChem网站（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）输入药物名称sakuranetin获取樱花素的分子式，进而将其分子式通过Swiss数据库（http：//swisstargetprediction.ch/）预测该药物的潜在靶点基因，删除P值为0的靶点基因。通过GeneCards（https：//www.genecards.org/）、TTD（https：//db.idrblab. net/ttd/）、DrugBank（https：//go.drugbank.com/）、OMIM（https：//www.omim.org/）、PharmGKB（https：//www.pharmgkb.org/）数据库输入疾病名称spinal cord injury检索SCI相关靶点，所有数据汇总后删除重复靶点基因，选择人源基因并剔除得分为0.1以下的靶点基因。最终利用Venny网站（https：//bioinfogp.cnb. csic.es/tools/venny/index.html）将樱花素靶点基因与SCI靶点基因进行对比，获取韦恩图，其交集部分可能为樱花素治疗SCI的靶点基因。

1.12" 基因本体功能及京都基因与基因组百科全书通路富集分析

将樱花素治疗SCI的交集靶点基因导入DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），基因类型选择Homo sapiens，于Gene Ontology及Pathways条目下，进行基因本体（gene ontology，GO）功能和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。GO功能富集包括生物过程、细胞组分和分子功能。通过微生信-在线生物信息学分析、可视化云平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/），导入GO及KEGG富集的相关数据（分组、基因数以及P值），绘制相关富集条形图。

1.13" 逆转录实时荧光定量PCR

使用Trizol试剂从SCI小鼠脊髓组织和BV2细胞中提取总的RNA，然后使用逆转录试剂盒合成cDNA。进而以cDNA为模板，加入PCR反应液，最终在Quant Studio实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增。以β-actin为内参，利用2-ΔΔCt法进行实时荧光定量PCR结果相对定量分析。引物序列：TNF-α上游引物5’-CAGGCGGTGCCTATGTCTC-3’，下游引物5’-CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG-3’；IL-6上游引物5’-TCTATACCACTTCACAAGTCGGA-3’，下游引物5’-GAATTGCCATTGCACAACTCTTT-3’；IL-1β上游引物5’-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3’，下游引物5’-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3’；β-actin上游引物5’-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3’，下游引物5’-GCCGGACTCATCGTACTCC-3’。

1.14" 酶联免疫吸附实验

准备SCI小鼠脊髓组织匀浆的上清及BV2细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度。于酶标仪450 nm处检测吸光度值。

1.15" 免疫荧光染色

脊髓组织冰冻切片和BV2细胞爬片用4%多聚甲醛固定后，0.2% TritonX-100通透15 min，再用5 %的山羊血清封闭30 min，加入CD68（1∶500）和CD11b（1∶200）在4 ℃下孵育过夜。次日加入相应的二抗［山羊抗小鼠IgG Hamp;L（1∶1000）、山羊抗兔IgG Hamp;L（1∶500）］室温避光孵育2 h，最后滴加DAPI复染细胞核。使用荧光显微镜获取荧光图像，随机选取6个视野对CD11b+CD68+细胞以及CD68+细胞进行计数。

1.16" Western blot

将SCI小鼠脊髓组织匀浆液与BV2细胞中加入RIPA裂解液（含有蛋白酶和磷酸化酶抑制剂）提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量分析。将等量的蛋白样品加至SDS-PAGE凝胶孔中，然后转移到PVDF膜上，加入5%的脱脂牛奶封闭1 h后，加入一抗［PI3K、Akt、p-PI3K（Ser473）、p-Akt、IGF-1、GAPDH，1∶1000］。第2天，加入相对应的辣根过氧化物酶标记的二抗，使用ECL发光液进行发光显影，曝光后使用Image J软件进行蛋白条带分析。实验重复3次。

1.17" 统计学处理

采用GraphPad Prism 9软件进行数据分析。符合正态分布且方差齐的计量资料以均数±标准差表示，两组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。Plt;0.05为差异有统计学意义。

2" 结果

2.1" 樱花素对SCI小鼠运动功能的影响

小鼠SCI造模成功后，在不同时间点利用BMS评分、斜板实验、游泳实验及脚印分析的方法评估SCI小鼠运动功能的恢复情况。BMS评分结果显示，与SCI组比较，樱花素组小鼠BMS评分在术后第14天起显著增加（P均＜0.001）（图1A）。斜板实验结果显示，经樱花素治疗的SCI小鼠后肢承重能力在术后第14天起显著高于SCI组（P均＜0.001）（图1B）。游泳实验结果显示，相较于SCI组小鼠，樱花素治疗小鼠游泳时后肢的活动度增加，前肢依赖程度显著降低，且自术后第14天起游泳评分显著提高（P均＜0.001）（图1C、1D）。脚印分析结果显示，相较于SCI组，樱花素组小鼠足迹更清晰协调且脚印分析得分更高（P=0.044）（图1E、1F）。

2.2" 樱花素对SCI后组织病理损伤面积的影响

HE染色结果显示，SCI后，SCI组小鼠脊髓组织出现严重损伤，樱花素治疗后SCI小鼠脊髓组织可见少量损伤面积［（25.85±6.08）%比（60.31±14.84）%，P＜0.001］（图2A、2B）。劳克坚牢蓝染色结果显示，樱花素治疗后SCI小鼠髓鞘化面积显著多于SCI组［（30.02±9.20）%比（11.44±4.84）%，P=0.001］（图2C、2D）。尼氏染色结果显示，相较于SCI组，经樱花素治疗后小鼠脊髓前角残留的运动神经元数量显著增加［（19.50±5.13）个比（5.00±3.46）个，P＜0.001］（图2E、2F）。

2.3" 樱花素对SCI后炎症因子的分泌和小胶质细胞活化的影响

韦恩图结果显示，樱花素与SCI疾病的交集靶点基因共有31个（图3A）。将31个靶点基因进行GO功能富集分析，生物过程主要涉及炎症反应、对异生物刺激的反应、负向调节细胞增殖、DNA生物合成过程的正向调节及信号转导等。细胞组分主要集中在细胞外区域、血小板α颗粒腔、转录因子复合物、质膜及膜等。分子功能主要涉及RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、酶结合、类固醇激素受体活性、类固醇结合及相同蛋白结合等。生物过程中炎症反应所对应的P值显著性最高，因此，樱花素在SCI中的功能途径可能与炎症反应相关（图3B）。逆转录实时荧光定量PCR结果显示，SCI小鼠组织中促炎因子TNF-α、IL-6及IL-1β的浓度显著增加，而经樱花素治疗后显著抑制了小鼠脊髓组织中炎症因子的释放（P=0.006，P=0.001，P＜0.001）（图3C）。ELISA结果与逆转录实时荧光定量PCR结果趋势相一致（P=0.028，P=0.001，P=0.002）（图3D）。免疫荧光结果显示，樱花素治疗后小胶质细胞的活化数量显著低于SCI组［（567.17±113.65）个/mm2比（1017.67±115.90）个/mm2，P＜0.001］（图3E、3F）。

2.4" 樱花素对BV2细胞的活化和炎症因子分泌的影响

CCK-8结果显示，0～200 μmol/L 樱花素未引起BV2细胞显著的细胞毒性且浓度为50 μmol/L时保护细胞能力最佳（P＜0.001）（图4A、4B）。因此，后续体外实验中樱花素的实验浓度采用50 μmol/L。逆转录实时荧光定量PCR与ELISA结果显示，樱花素可显著降低脂多糖诱导BV2细胞释放炎症因子TNF-α（P=0.010，P＜0.001）、IL-6（P均＜0.001）和IL-1β（P＜0.001，P=0.027）（图4C、4D）。免疫荧光结果显示，樱花素处理可显著降低脂多糖引起的BV2细胞的活化数量［（456.67±166.38）个/mm2比（918.83±165.40）个/mm2，P＜0.001］（图4E、4F）。

2.5" 樱花素与SCI后PI3K/Akt信号通路的关系

KEGG通路富集分析显示，樱花素可能通过调控PI3K/Akt信号通路干预SCI（图5A）。Western blot结果显示，与脂多糖组相比，樱花素干预显著降低PI3K及Akt蛋白磷酸化水平（P均＜0.001）（图5B、5C）。与LPS+樱花素组相比，IGF-1的进一步干预显著提高了PI3K及Akt蛋白磷酸化水平（P=0.001，P＜0.001）；与LPS+IGF-1组相比，樱花素的进一步干预显著降低了IGF-1引起的p-PI3K及p-Akt的高表达（P均＜0.001）（图5D、5E）。

2.6" 樱花素通过PI3K/Akt信号通路对SCI后小胶质细胞活化和炎症因子分泌的影响

免疫荧光染色结果显示，与LPS+樱花素+IGF-1组相比，LPS+樱花素组小胶质细胞的活化数量显著减少（P=0.006）（图6A、6B）。逆转录实时荧光定量PCR及ELISA结果显示，樱花素对炎症因子TNF-α（P＜0.001，P=0.006）、IL-6（P=0.001，P＜0.001）和IL-1β（P=0.005，P=0.033）的抑制作用被IGF-1所逆转（图6C、6D）。

3" 讨论

SCI常导致患者严重的神经功能缺陷和生活质量下降，然而，目前临床常规用药治疗SCI效果尚不明确，研发有效治疗SCI的药物迫在眉睫［22-23］。本研究表明樱花素能够改善SCI小鼠的运动功能和脊髓组织损伤面积，可能通过抑制PI3K/Akt通路的激活，进而抑制小胶质细胞活化，减轻炎症反应。

樱花素是从樱桃树皮、水稻等提取的天然植物化合物，已被证明在中枢神经系统疾病中发挥着一定的保护作用［10］。既往研究显示，BMS评分、斜板实验、游泳实验以及脚印分析在内的多种行为学检测方法，能够从不同的角度综合评估小鼠SCI后运动功能的恢复情况［11］。本研究显示樱花素治疗组小鼠BMS评分、斜板角度以及游泳评分显著高于SCI组，足迹分析显示樱花素治疗可改善SCI小鼠行走后肢拖拽现象，足迹较为清晰协调。既往研究显示，SCI小鼠脊髓组织呈现大量病变面积和严重的脱髓鞘现象，且存在神经元的大量丢失［24］。本研究显示与SCI组相比，樱花素组小鼠脊髓组织的损伤面积显著减少，髓鞘保留增加，并且脊髓前角残留的神经元数量显著增加，表明樱花素治疗显著改善小鼠的运动功能障碍和脊髓组织损伤。

为进一步明确樱花素在SCI中神经保护作用的途径，本研究通过GO功能富集分析显示，樱花素的功能

途径与炎症反应有关。既往多系统研究均显示樱花素具有拮抗炎症的生物学活性，能够通过降低TNF-α、IL-6和IL-1β的水平缓解脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤以及炎症性过敏性哮喘［12，25-26］。本研究显示，与SCI组比较，樱花素治疗组小鼠体内的促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达降低。既往研究表明，SCI后炎症因子的释放主要由活化的小胶质细胞所介导，而此种由小胶质细胞活化所介导的炎症反应是脊髓持续受损的重要因素［27-28］。本研究免疫荧光染色显示SCI后小胶质细胞活化数量明显增多，而樱花素治疗显著抑制了小胶质细胞活化数量；体外细胞实验表明樱花素组小胶质细胞激活标志物CD68的表达较脂多糖刺激组显著下降，炎症因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）释放减少，表明樱花素可通过抑制小胶质细胞活化减少炎症

因子的产生，从而改善SCI。然而其分子机制需要进行进一步研究和探索。

通过KEGG通路富集分析显示，樱花素在SCI的保护作用可能与调控PI3K/Akt通路有关。既往研究表明，樱花素通过抑制PI3K/Akt通路减轻软骨细胞炎症，从而延缓骨性关节炎的进展［29］。PI3K/Akt通路参与多种疾病中小胶质细胞的活化，成为抗炎治疗的重要靶点［30］。抑制PI3K/Akt通路的激活能够减弱脂多糖刺激下BV2小胶质细胞的活化和促炎介质的释放［31-32］。本研究Western blot结果显示，与脂多糖组比较，樱花素显著抑制脂多糖引起的PI3K和Akt蛋白磷酸化水平的提高。IGF-1在不同环境或细胞类型中可能存在双重作用，有研究表明IGF-1促进BV2细胞和星形胶质细胞的吞噬功能通过激活PI3K/Akt途径所介导［33-34］。而在肢端肥大症中，IGF-1显著增强人外周血单核细胞的促炎反应［35］。既往研究显示，IGF-1为PI3K/Akt通路的经典激活剂，已被证明在多种细胞中能够激活该通路［20，36］。因此，本研究于樱花素组加入IGF-1进一步探究樱花素对该通路的作用，结果显示IGF-1显著逆转樱花素对PI3K/Akt通路的抑制作用，并且樱花素的干预显著抑制了IGF-1对PI3K/Akt通路的激活作用。BV2细胞在樱花素的处理下，IGF-1作为PI3K/Akt通路激活剂逆转了樱花素的抗炎效果。经IGF-1干预后小胶质细胞活化的数量增多，同时TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平提高。

本研究存在一定的局限性。SCI后小胶质细胞活化所涉及的分子机制错综复杂，本研究仅对PI3K/Akt通路进行了探索，在此过程中是否存在其他相关分子机制仍需进一步研究。

综上，本研究证实小鼠SCI后樱花素治疗可以减轻小胶质细胞产生的炎症反应并提高SCI小鼠的运动能力。此外，本研究还揭示了樱花素可能通过PI3K/Akt信号通路抑制小胶质细胞活化介导的炎症反应，有望为开发新的SCI治疗方案和药物提供重要的理论支持。

利益冲突" 所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明" 肖林雨：设计并实施实验、统计数据、撰写论文；陈悦、段婷、孙洋、许轶博、赵雅静：设计实验、实验实施、收集数据、整理数据；宋雪、闫兴洲：指导研究、修改论文；胡建国：指导研究、修改论文、提供基金支持

参" 考" 文" 献

［1］Anjum A，Yazid MD，Fauzi Daud M，et al.Spinal cord injury：pathophysiology，multimolecular interactions，and underlying recovery mechanisms［J］.Int J Mol Sci，2020，21（20）：7533.DOI：10.3390/ijms21207533.

［2］Hersh AM，Weber-Levine C，Jiang K，et al.Spinal cord injury：emerging technologies［J］.Neurosurg Clin N Am，2024，35（2）：243-251.DOI：10.1016/j.nec.2023.10.001.

［3］Freyermuth-Trujillo X，Segura-Uribe JJ，Salgado-Ceballos H，et al.Inflammation：a target for treatment in spinal cord injury［J］.Cells，2022，11（17）：2692.DOI：10.3390/cells11172692.

［4］Brockie S，Hong J，Fehlings MG.The role of microglia in modulating neuroinflammation after spinal cord injury［J］.Int J Mol Sci，2021，22（18）：9706.DOI：10.3390/ijms22189706.

［5］Bi J，Sun P，Feng E，et al.Melatonin synergizes with methylprednisolone to ameliorate acute spinal cord injury［J］.Front Pharmacol，2022，12（1）：723913.DOI：10.3389/fphar.2021.723913.

［6］Wang R，Bai J.Pharmacological interventions targeting the microcirculation following traumatic spinal cord injury［J］.Neural Regen Res，2024，19（1）：35-42.DOI：10.4103/1673-5374.375304.

［7］Junaid M，Basak B，Akter Y，et al.Sakuranetin and its therapeutic potentials-a comprehensive review［J］.Z Naturforsch C J Biosci，2023，78（1-2）：27-48.DOI：10.1515/znc-2022-0024.

［8］Stompor M.A review on sources and pharmacological aspects of sakuranetin［J］.Nutrients，2020，12（2）：513.DOI：10.3390/nu12020513.

［9］Santana FPR，da Silva RC，Grecco SDS，et al.Inhibition of MAPK and STAT3-SOCS3 by sakuranetin attenuated chronic allergic airway inflammation in mice［J］.Mediators Inflamm，2019，2019：1356356.DOI：10.1155/2019/1356356.

［10］Li C，Hu C，Wang R，et al.Protective effect of sakuranetin in brain cells of dementia model rats［J］.Cell Mol Biol （Noisy-le-grand），2019，65（5）：54-58.DOI：10.14715/cmb/2019.65.5.9.

［11］Gong F，Ge T，Liu J，et al.Trehalose inhibits ferroptosis via NRF2/HO-1 pathway and promotes functional recovery in mice with spinal cord injury［J］.Aging （Albany NY），2022，14（7）：3216-3232.DOI：10.18632/aging.204009.

［12］Bittencourt-Mernak MI，Pinheiro NM，Santana FP，et al.Prophylactic and therapeutic treatment with the flavonone sakuranetin ameliorates LPS-induced acute lung injury［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2017，312（2）：L217-L230.DOI：10.1152/ajplung.00444.2015.

［13］Basso DM，Fisher LC，Anderson AJ，et al.Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains［J］.J Neurotrauma，2006，23（5）：635-659.DOI：10.1089/neu.2006.23.635.

［14］Wang Q，Gao P，Liu H，et al.GIT1 promotes axonal growth in an inflammatory environment by promoting the phosphorylation of MAP1B［J］.Oxid Med Cell Longev，2022，3（16）：7474177.DOI：10.1155/2022/7474177.

［15］Smith RR，Burke DA，Baldini AD，et al.The Louisville swim scale：a novel assessment of hindlimb function following spinal cord injury in adult rats［J］.J Neurotrauma，2006，23（11）：1654-1670.DOI：10.1089/neu.2006.23.1654.

［16］Xu Y，Geng Z，Sun Y，et al.Complanatuside a improves functional recovery after spinal cord injury through inhibiting JNK signaling-mediated microglial activation［J］.Eur J Pharmacol，2024，2（15）：176287.DOI：10.1016/j.ejphar.2023.176287.

［17］Hu Z，Xuan L，Wu T，et al.Taxifolin attenuates neuroinflammation and microglial pyroptosis via the PI3K/Akt signaling pathway after spinal cord injury［J］.Int Immunopharmacol，2023，114（1）：109616.DOI：10.1016/j.intimp.2022.109616.

［18］Metz GA，Merkler D，Dietz V，et al.Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats［J］.Brain Res，2000，883（2）：165-177.DOI：10.1016/s0006-8993（00）02778-5.

［19］Liu Z，Yao X，Sun B，et al.Pretreatment with kaempferol attenuates microglia-mediate neuroinflammation by inhibiting MAPKs-NF-κB signaling pathway and pyroptosis after secondary spinal cord injury［J］.Free Radic Biol Med，2021，168（5）：142-154.DOI：10.1016/j.freeradbiomed.2021.03.037.

［20］Li H，Kong R，Wan B，et al.Initiation of PI3K/AKT pathway by IGF-1 decreases spinal cord injury-induced endothelial apoptosis and microvascular damage［J］.Life Sci，2020，263（12）：118572.DOI：10.1016/j.lfs.2020.118572.

［21］Cui F，He X.IGF-1 ameliorates streptozotocin-induced pancreatic β cell dysfunction and apoptosis via activating IRS1/PI3K/Akt/FOXO1 pathway［J］.Inflamm Res，2022，6（5-6）：669-680.DOI：10.1007/s00011-022-01557-3.

［22］Heinemann U，Freund M.Diagnostic strategies in spinal trauma［J］.Eur J Radiol，2006，58（1）：76-88.DOI：10.1016/j.ejrad.2005.12.007.

［23］Zhao C，Xing Z，Zhang C，et al.Nanopharmaceutical-based regenerative medicine：a promising therapeutic strategy for spinal cord injury［J］.J Mater Chem B，2021，9（10）：2367-2383.DOI：10.1039/d0tb02740e.

［24］Zhang L，Zhang W，Zheng B，et al.Sinomenine attenuates traumatic spinal cord injury by suppressing oxidative stress and inflammation via Nrf2 pathway［J］.Neurochem Res，2019，44（4）：763-775.DOI：10.1007/s11064-018-02706-z.

［25］Toledo AC，Sakoda CP，Perini A，et al.Flavonone treatment reverses airway inflammation and remodelling in an asthma murine model［J］.Br J Pharmacol，2013，168（7）：1736-1749.DOI：10.1111/bph.12062.

［26］Lutz JA，Kulshrestha M，Rogers DT，et al.A nicotinic receptor-mediated anti-inflammatory effect of the flavonoid rhamnetin in BV2 microglia［J］.Fitoterapia，2014，98：11-21.DOI：10.1016/j.fitote.2014.06.012.

［27］Xu L，Wang J，Ding Y，et al.Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury［J］.Front Neurol，2022，12：796704.DOI：10.3389/fneur.2021.796704.

［28］Brennan FH，Li Y，Wang C，et al.Microglia coordinate cellular interactions during spinal cord repair in mice［J］.Nat Commun，2022，13（1）：4096.DOI：10.1038/s41467-022-31797-0.

［29］Deng X，Qu Y，Li M，et al.Sakuranetin reduces inflammation and chondrocyte dysfunction in osteoarthritis by inhibiting the PI3K/AKT/NF-κB pathway［J］.Biomed Pharmacother，2024，171：116194.DOI：10.1016/j.biopha.2024.116194.

［30］He X，Li Y，Deng B，et al.The PI3K/AKT signalling pathway in inflammation，cell death and glial scar formation after traumatic spinal cord injury：mechanisms and therapeutic opportunities［J］.Cell Prolif，2022，55（9）：e13275.DOI：10.1111/cpr.13275.

［31］Nam OH，Kim JH，Kang SW，et al.Ginsenoside Rb1 alleviates lipopolysaccharide-induced inflammation in human dental pulp cells via the PI3K/Akt，NF-κB，and MAPK signalling pathways［J］.Int Endod J，2024，57（6）：759-768.DOI：10.1111/iej.14058.

［32］Han Y，Wang L，Ye X，et al.FcγRIIb exacerbates LPS-induced neuroinflammation by binding with the bridging protein DAP12 and promoting the activation of PI3K/AKT signaling pathway in microglia［J］.J Inflamm Res，2024，17（1）：41-57.DOI：10.2147/JIR.S428093.

［33］翟丽倩，陈晓芬，卢思彤，等.胰岛素样生长因子1（IGF-1）通过激活PI3K/AKT信号通路增强小鼠BV-2小胶质细胞的吞噬功能［J］.细胞与分子免疫学杂志，2021，37（3）：199-204.DOI：10.13423/j.cnki.cjcmi.009156.

［34］Pinto-Benito D，Paradela-Leal C，Ganchala D，et al.IGF-1 regulates astrocytic phagocytosis and inflammation through the p110α isoform of PI3K in a sex-specific manner［J］.Glia，2022，70（6）：1153-1169.DOI：10.1002/glia.24163.

［35］Wolters T，Netea MG，Hermus A，et al.IGF1 potentiates the pro-inflammatory response in human peripheral blood mononuclear cells via MAPK［J］.J Mol Endocrinol，2017，59（2）：129-139.DOI：10.1530/JME-17-0062.

［36］Zhang D，Yuan Y，Zhu J，et al.Insulin-like growth factor 1 promotes neurological functional recovery after spinal cord injury through inhibition of autophagy via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway［J］.Exp Ther Med，2021，22（5）：1265.DOI：10.3892/etm.2021.10700.

（收稿日期：2024-03-18）