耐碳青霉烯鼠伤寒沙门菌的药敏及分子特征分析

王燕 王云英 蒋敏 张雨虹 任艳丽 孙滨

摘要：目的 分析鼠傷寒沙门菌的耐药情况及分子特征，为临床治疗和感染防控提供依据。方法 对我院分离的鼠伤寒沙门菌CYEY-S001，采用VITEK2-Compact全自动微生物分析系统和K-B纸片法对药敏结果进行检测。通过全基因组测序分析其基因和分子特征，并进行质粒接合试验，研究质粒的可转移性。利用碳青霉烯酶表型试验检测其实所含的碳青霉烯酶类型，PCR确认其携带的耐药基因，质粒复制子分型确定质粒类型。结果 该鼠伤寒沙门菌CYEY-S001对除氨曲南之外的青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素全部耐药，全基因组测序分析表明其为ST34型鼠伤寒沙门菌，含有blaNDM-5、aac（6）-Iaa、floR、cmlA1、sul3和tet（A）等多种耐药基因。携带的质粒类型为IncHI2，blaNDM-5位于该质粒上，可通过水平转移，结合子获得了与鼠伤寒沙门菌完全一致的耐药结果。3种碳青霉烯酶表型试验均正确识别出了其携带碳青霉烯酶的类型为金属β-内酰胺酶。结论 碳青霉烯耐药鼠伤寒沙门菌对感染治疗和预防控制带来了新的挑战。新发现的IncHI2-blaNDM-5质粒存在向其他细菌物种横向传播的风险。

关键词：鼠伤寒沙门菌；碳青霉烯耐药；表型检测；质粒复制子分型；IncHI2-blaNDM-5

中图分类号：R978.1  文献标志码：A

The resistance pattern and molecular characteristics

of carbapenem resistant Salmonella typhimurium

Wang Yan， Wang Yunying， Jiang Min， Zhang Yuhong， Ren Yan-li， and Sun Bin

（Department of Laboratory Medicine， the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University， Chongqing 400010）

Abstract    Objective To analyze the resistance pattern and molecular characteristics of carbapenem resistant Salmonella typhimurium， and provide evidence for clinical treatment and infection prevention and control. Methods   The antibiotic susceptibility testing of carbapenem resistant Salmonella typhimurium CYEY-S001 isolated from our hospital was performed by VITEK2-Compact automatic bacterial analysis system and the K-B disk method. The gene and molecular characteristics were analyzed by whole genome sequencing （WGS）， and the conjugation test was carried out to study the transferability of the plasmid. Carbapenemase phenotypic assays were used to detect the carbapenemase type. PCR was used to confirm the resistance genes， and plasmid replicon typing was used to determine the plasmid type. Results The Salmonella typhimurium CYEY-S001 was resistant to penicillins， cephalosporins and carbapenems except for aztreonam. The WGS analysis showed that the Salmonella typhimurium CYEY-S001 belonged to the ST34 type， which contained blaNDM-5， aac（6）-Iaa， floR， cmlA1， sul3 and tet（A） resistance genes. The Salmonella typhimurium CYEY-S001 contained IncHI2 plasmid， on which blaNDM-5 was located. The antibiotic susceptibility results of the transconjugant were completely consistent with the Salmonella typhimurium CYEY-S001. The three phenotypic tests correctly identified the type of carbapenemase as metal β-lactamase. Conclusion  Carbapenem resistant Salmonella typhimurium presents new challenges for infection treatment， prevention and control. The newly IncHI2-blaNDM-5 plasmid has the risk of horizontal transmission to other bacterial species.

Key words Salmonella typhimurium; Carbapenem-resistant; Phenotypic assay; Plasmid replicon typing; IncHI2-blaNDM-5

沙门菌是全球食源性疾病的主要原因之一，沙门菌感染已成为一个重大的公共卫生问题，对卫生系统造成了越来越大的经济负担[1]。据估计，全球每年约有9380万胃肠炎病例和15.5万例死亡归因于非伤寒沙门菌，它是引起人类细菌性肠炎的常见原因。在众多非伤寒沙门菌血清型中，鼠伤寒沙门菌和肠炎沙門菌是引起人类沙门菌病的两种最常见的血清型[2]。近年来，鼠伤寒沙门菌的耐药率一直在增加，多重耐药的鼠伤寒沙门菌给临床治疗带来了困难，导致发病率和死亡率增长[3]。碳青霉烯类抗生素通常被认为是治疗多重耐药细菌感染的最有效抗菌药物，随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用和碳青霉烯酶的水平传播，耐碳青霉烯鼠伤寒沙门菌也偶有检出[4-5]，对有效治疗和感染控制带来了新的挑战。本研究结合表型和基因组数据，对分离到的耐碳青霉烯鼠伤寒沙门菌的药敏谱和分子特征进行了分析，并验证了携带碳青霉烯耐药基因的质粒可通过水平转移，为评估其传播风险和开展疾病监测防控提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

在一个白血病患者的腹泻大便样本中，分离出一株碳青霉烯耐药的鼠伤寒沙门菌CYEY-S001。该菌通过毅新博创飞行时间质谱系统进行鉴定，进一步的沙门菌血清型测定按照Kauffmann-White方案进行[6]。利福平耐药的大肠埃希菌EC600作为接合试验的受体菌。利用VITEK2-Compact全自动微生物分析系统进行细菌药敏试验，并通过K-B纸片法对药敏结果进行复核，结果按照2020版美国临床实验室标准化协会（CLSI）规则和标准判定[7]。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。

1.2 主要仪器和试剂

哥伦比亚血平板和MH平板（美国赛默飞公司）；沙门菌属诊断血清（宁波天润生物药业有限公司）、抗菌药物纸片、MH琼脂和TSB肉汤（英国Oxoid公司）；Ezup柱式细菌DNA提取试剂（生工生物工程（上海）股份有限公司）；碳青霉烯酶表型检测试剂盒（上海原科公司）；碳青霉烯酶检测卡（北京金山川公司）；Clin-TOF II飞行时间质谱系统（北京毅新博创生物科技有限公司）；VITEK2-Compact自动化鉴定和药敏系统（法国生物梅里埃公司）；PCR相关试剂（大连TAKARA公司）；PCR仪和凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 细菌的全基因组测序与生信分析

全基因组测序在生工生物工程（上海）股份有限公司完成。在Illumina Hiseq?平台上进行二代测序，使用SPAdes对二代测序数据进行拼装，然后采用GapFiller对拼接得到的contig补GAP，最后采用PrInSeS-G进行序列矫正。采用NCBI Blast+将基因蛋白序列与CDD、KOG、COG、NR、NT、PFAM、Swissprot、TrEMBL等多个数据库进行比对，得到其功能注释信息。根据基因与Swissprot、TrEMBL的注释结果得到GO功能注释信息。利用KAAS得到基因KEGG注释信息。通过ResFinder 4.1分析菌株携带的所有耐药基因。通过MLST 2.0检测菌株所属的多位点序列分型。

1.4 质粒接合试验

挑取供体菌（鼠伤寒沙门菌CYEY-S001）和受体菌（EC600）单个菌落接种至5 mL LB培养基中，37 ℃ 200 r/min培养14 h。而后分别吸取500 ?L受体菌和供体菌，加入到4 mL LB培养基中，37 ℃ 200 r/min培养4 h后，静置4 h。吸取混合培养菌液100 ?L，均匀涂布在含利福平（200 ?g/mL）-美罗培南（1 ?g/mL）混合抗生素的筛选MH平板上，培养18 h。挑取在筛选平板上生长疑似接合子菌落进行质谱鉴定及药敏试验，并进行后续基因测定。

1.5 碳青霉烯酶表型检测试验

采用改良碳青霉烯灭活试验（mCIM）联合EDTA-改良碳青霉烯酶灭活试验（eCIM）检测碳青霉烯酶表型，具体操作参照CLSI M100[8]。并根据“CHINET中国细菌耐药监测网技术方案（2020年更新版）”，采用3-氨基苯硼酸（APB）和EDTA联合酶抑制剂增强试验法再次确认碳青霉烯酶类型（http：//www.chinets.com/Document）。并使用碳青霉烯酶检测卡初步确认菌株携带的碳青霉烯酶。

1.6 耐药基因检测

在Center for Genomin Epidemioligy（http：//www.genomicepidemiology.org/）利用ResFinder 4.1对获得的鼠伤寒沙门菌CYEY-S001全基因组数据进行耐药基因分析。并提取CYEY-S001、EC600和接合子的DNA，采用PCR方法检测各种类型的耐药基因，包括超广谱β-内酰胺酶类（blaCTX-M、blaSHV、blaTEM）、头孢菌素酶类（blaACC、blaACT、blaMOX、blaEBC、blaDHA）、碳青霉烯酶类（blaNDM、blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaOXA-48）、氨基糖苷类（armA、rmtB、aac（6）-Iaa）和喹诺酮类（qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、aac（6）-Ib-cr）。blaNDM引物序列为：F-5'- ATGGAATTGCCCAATATTATGCACCC-3'，R-5'-TCAGCGCAGCTTGTCGGC-3'，PCR反应条件：95℃预变性5 min，然后95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。其余耐药基因引物及扩增条件见文献[9]。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统观察结果。阳性扩增产物测序后经BLAST比对确认（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。

1.7 质粒复制子分型

在Center for Genomin Epidemioligy利用PlasmidFinder 2.1对获得的鼠伤寒沙门菌CYEY-S001全基因组数据进行质粒分析。并采用基于主要质粒不相容群复制子的PCR分型（PBRT）方法，检测FIA、FIB、FIC、HI1、HI2、I1-Iγ、L/M、N、P、W、T、A/C、K、B/O、X、Y、F和FIIA共18种Inc质粒，来确认鼠伤寒沙门菌CYEY-S001和结合子携带的质粒类型。使用引物及PCR扩增条件参照文献[10]。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统观察结果。阳性扩增产物测序后经BLAST比對确认。

2 结果

2.1 菌株鉴定结果及MLST分型

毅新博创飞行时间质谱系统鉴定该菌株结果为沙门菌属，沙门血清凝集试验结果显示，该菌株血清型为4， [5]， 12：i：-，最终鉴定为鼠伤寒沙门菌。MLST分型比对结果显示，该鼠伤寒沙门菌CYEY-S001等位基因类型为aroC-10、dnaN-19、hemD-12、hisD-9、purE-5、sucA-9和thrA-2，属于ST34型。

2.2 鼠伤寒沙门菌基因组信息

全基因组数据显示，该鼠伤寒沙门菌CYEY-S001的总碱基数目为5096737 bp，G+C的含量为51.9%，蛋白编码基因数目为5088个，转运RNA数目为75，核糖体RNA数目为7，重复区域数目为198，各数据库对基因功能注释结果见图1。

2.3 接合试验结果

在筛选平板上生长的接合子菌落经质谱鉴定为大肠埃希氏菌，该接合子对碳青霉烯类和头孢菌素类抗菌药物耐药，对氨基糖苷类药物的敏感性降低，而对氟喹诺酮类药物保持敏感。能够扩增出和供体菌相同的碳青霉烯酶耐药基因，质粒分型结果与供体菌一致，提示接合试验成功，该鼠伤寒沙门菌CYEY-S001携带的含blaNDM质粒能够进行水平传播。

2.4 抗生素药敏试验结果

鼠伤寒沙门菌CYEY-S001对氨苄西林、氨苄西林舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢替坦、厄他培南、亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、妥布霉素、四环素等16种抗生素耐药，对环丙沙星和左氧氟沙星中介，对氨曲南和阿米卡星及复方磺胺敏感。所获得的接合子青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素药敏结果与鼠伤寒沙门菌CYEY-S001完全一致，EC600对各种抗生素均敏感。具体药敏结果见表1。

2.5 碳青霉烯酶表型试验检测结果

mCIM联合eCIM结果显示，鼠伤寒沙门菌CYEY-S001的mCIM和eCIM均为阳性，产金属酶（图2）；酶抑制剂增强试验表明，鼠伤寒沙门菌CYEY-S001所产的碳青霉烯酶能够被EDTA抑制，不能够被3-氨基苯硼酸抑制，为金属酶（图3）。碳青霉烯酶检测卡检测结果进一步证实，该金属酶为NDM型碳青霉烯酶（图4）。接合试验获得的接合子，酶型检测结果与鼠伤寒沙门菌CYEY-S001一致。EC600的表型试验均为阴性。

2.6 耐药基因检测结果

ResFinder 4.1分析结果显示，鼠伤寒沙门菌CYEY-S001携带blaNDM-5、aac（6）-Iaa、floR、cmlA1、sul3和tet（A）等多种耐药基因。PCR检测结果显示，在扩增的各类耐药基因中，鼠伤寒沙门菌CYEY-S001和结合子的blaNDM和aac（6）-Iaa阳性，blaNDM经测序比对分析为NDM-5（图5）。blaNDM-5和aac（6）-Iaa两个耐药基因位于同一质粒上，可以从鼠伤寒沙门菌CYEY-S001转移到受体菌上。

2.7 质粒分型结果

PlasmidFinder 2.1分析结果显示，鼠伤寒沙门菌CYEY-S001携带的质粒类型为IncHI2。质粒复制子分型结果表明，鼠伤寒沙门菌CYEY-S001和接合子均能够扩增出IncHI2质粒片段（图6），提示IncHI2为携带各种耐药基因的质粒，可通过水平传播。

3 讨论

鼠伤寒沙门菌的宿主众多，分布广泛，不仅可以感染动物，也可以通过受污染的食物传播给人类，且鼠伤寒沙门菌引起的死亡率比沙门菌引起的平均死亡率高3倍[11]。不同ST型的鼠伤寒沙门菌表现出不同的生物学特性，如毒力和耐药性。近年来，ST34型鼠伤寒沙门菌的比例逐年增加，已取代ST19成为主要流行的ST型[11]。我们分离到的这株鼠伤寒沙门菌CYEY-S001即为ST34型。药敏结果显示，其对除氨曲南之外的青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素全部耐药，基因检测结果证实，引起耐药的主要原因为携带blaNDM-5碳青霉烯酶耐药基因。blaNDM基因编码的NDM碳青霉烯酶属于B类金属β-内酰胺酶，需依赖金属离子发挥其催化活性，能够水解除氨曲南以外的大多数β-内酰胺类抗生素。自2009年blaNDM-1在印度发现以来，目前已经出现了近40种blaNDM基因亚型。与NDM-1碳青霉烯酶相比，NDM-5的88（缬氨酸Val→亮氨酸Leu）和154（蛋氨酸Met→亮氨酸Leu）氨基酸发生改变，导致携带blaNDM-5基因的菌株对碳青霉烯类抗生素、头孢菌素的水解活性增强[12]。blaNDM基因大多数位于耐药菌的质粒上，携带blaNDM基因的质粒为其进入宿主提供了有利条件，也为blaNDM基因在不同菌属之间的传播提供了基础。

质粒是细菌染色体外的闭合环状DNA片段，能够自主复制，具有不相容性。肠杆菌目细菌携带耐药基因的质粒不相容群主要有FIA、FIB、FIC、HI1、HI2、I1-Iγ、L/M、N、P、W、T、A/C、K、B/O、X、Y、F和FIIA共18种[10]。本研究显示，该鼠伤寒沙门菌CYEY-S001携带的质粒类型为IncHI2。IncHI2质粒具有很高的柔韧性和遗传可塑性，在抗性决定因素的获得和传播中起着重要作用[13]。Wang等[14]从1名餐饮工作者中分离到了1株多重耐药的鼠伤寒沙门菌，其IncHI2质粒携带mcr-1、fosA3、blaCTX-M-14耐药基因，有可能成为耐多药食源性病原体的传播媒介。Chen等[15]报道了某医院呼吸护理病房一起由携带blaOXA-48的泛耐药沙门菌的引起的医院沙门菌病暴发的事件，该沙门菌同样含有的IncHI2质粒，上面携带了高达15种耐药基因。携带blaNDM-5的沙门菌感染也有报道，但是其blaNDM-5基因并不是位于IncHI2质粒上[8，16-17]。本课题组分离到这株多重耐药鼠伤寒沙门菌CYEY-S001含有携带blaNDM-5的IncHI2质粒，为首次报道。接合试验证实，该IncHI2-blaNDM-5质粒为自主转移质粒，能够携带耐药基因进行水平传播，IncHI2-blaNDM-5有可能作为耐药沙门菌传播的新途径。因此进一步研究其基因环境，阐明其遗传特征，深入探讨IncHI2-blaNDM-5质粒在鼠伤寒沙门菌中传播机制极其重要。

雖然沙门菌引起的肠炎具有自限性，但是感染碳青霉烯耐药沙门菌后不采取有效的治疗措施将会引起严重的后果。由于不同的酶抑制剂对不同类型碳青霉烯酶的抑制作用不同，尽早确定细菌携带的碳青霉烯酶种类对选择有效抗生素进行治疗具有重要的意义。基因检测是检测碳青霉烯酶的金标准，但是分子方法需要专业的技术人员、特殊的检测设备、成本昂贵和众多的潜在靶基因，限制了其在常规微生物实验室的应用。目前，基于碳青霉烯酶特性的各种表型测定方法已被开发，包括改良Hodge试验、Carba NP试验、mCIM和eCIM、酶抑制剂增强试验及商品化酶型检测试剂盒等等，非常适合在在微生物实验室开展。本研究选择了mCIM联合eCIM、酶抑制剂增强试验及酶型检测卡 3种表型检测方法对鼠伤寒沙门菌CYEY-S001携带的碳青霉烯酶进行了测定。结果显示，3种表型检测均正确识别出了其携带碳青霉烯酶的类型为金属β-内酰胺酶，为后续临床治疗提供了有价值的信息。综合成本、操作繁简及其优缺点，我们推荐酶抑制剂增强试验作为碳青霉烯酶筛查的常规方法。

由于沙门菌属的性质，在医疗保健和社区环境中都有很大的传播潜力。碳青霉烯耐药鼠伤寒沙门菌的出现，对感染治疗和预防控制带来了新的挑战。新发现的IncHI2质粒介导的blaNDM-5也存在向其他细菌物种横向传播的风险。深入研究IncHI2-blaNDM-5的传播机制，早期监测碳青霉烯酶的类型，为临床医生合理选择抗生素治疗，控制其进一步传播具有重要的意义。

参 考 文 献

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