基于细胞膜损伤机制的抗菌肽结构优化研究进展

张良 潘滢浩 袁瑜 黄波 孟广鹏 李元波 周琳

摘要：抗菌肽相比传统抗生素，具有广谱杀菌、对多重耐药菌有效、生物相容性好等优点。近年来，抗菌肽独特的细胞膜靶向作用机制得到了深入研究，基于此機制上的结构优化策略也成为了近期研究热点。本文主要针对抗菌肽的细胞膜损伤机制展开，就近期通过氨基酸替换、线性肽成环、化学修饰、多聚化、抗生素偶联以及复合材料制备等手段对抗菌肽结构予以优化的研究进展进行了总结，期望对抗菌肽设计与改构研究提供思路。

关键词：抗菌肽；临床前研究；结构优化

中图分类号：R978文献标志码：A

Research progress on structure modification of antimicrobial peptides targeting membrane disruption

Zhang Liang1， Pan Yinghao2， Yuan Yu2，3， Huang Bo2， Meng Guangpeng2， Li Yuanbo2， and Zhou Lin1

（1 Chengdu Institute For Drug Control， Chengdu 610045; 2 Chengdu Sintanovo Biotechnology Co.， Ltd.， Sichuan Province， Chengdu 610000; 3 College of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610000）

Abstract Comparing to traditional antibiotics， antimicrobial peptides （AMPs） have the advantages of broad spectrum antibacterial activity， active against multidrug resistant bacteria and good biocompatibility. The unique cell membrane targeting mechanism of AMPs has been studied in depth， and the structure optimization strategies based on this basis have become hotspots in recent years. In this paper， we focus on the research progress of optimization strategies based on the membrane damage mechanism of AMPs， including amino acid replacement， peptide cyclization， chemical modification， polymerization， antibiotic conjugation， combined materials， et al. We expect this review to provide ideas on design and modification in the development of AMPs.

Key words Antimicrobial peptides; Pre-clinical research; Structure optimization

抗菌肽（antimicrobial peptides， AMPs），有时也被称为宿主防御肽（host defense peptides， HDPs），是一种小分子多肽，通常由不到50个氨基酸残基组成。抗菌肽具有广谱的抗微生物活性，除了抗菌活性外，对真菌、寄生虫与病毒也有活性[1-3]，此外，抗菌肽也被发现具有其他多种生理功能，如免疫调节、促血管形成、促伤口愈合和抗肿瘤活性等[4-7]。天然抗菌肽来源广泛，除了人体外，在动物、植物、细菌、真菌乃至古生菌与原生动物中均发现了天然的抗菌肽[8]。目前已经报道了超过4000种抗菌肽[9]，其中大多数为带有正电荷、具有一定疏水性基团的两亲性多肽，主要通过影响细菌细胞膜发挥抗菌作用。抗菌肽的构象多样，可以是α-螺旋、β-折叠，线性延展或无规则卷曲，也可以是环肽或上述多种构象的混合，但大部分抗菌肽的构象为α-螺旋或β-折叠。由于当今微生物对传统抗生素的耐药性越来越强，临床对新型抗菌药物需求急切，而抗菌肽因为具有与传统抗生素所不同的抗菌机制，成为了一种拥有巨大潜力的新型抗菌分子类别，在近年来受到了广泛关注，并且在细菌感染、伤口愈合与炎症治疗等方面都具有临床应用前景[10-11]。本文从传统抗生素与抗菌肽的抗菌机制出发，分析了抗菌肽基于细胞膜损伤机制的抗菌构效关系，并对近年来基于细胞膜损伤机制的一些抗菌肽结构优化策略研究进展进行了介绍。

1 传统抗生素与抗菌肽的抗菌机制

传统抗生素通常是通过5种途径实现对病原细菌的攻击[12]：①抑制细菌细胞壁的合成（β-内酰胺类抗生素等）；②抑制细菌蛋白质合成（红霉素等）；③直接或间接抑制核酸（DNA/RNA）的合成或复制（利福霉素、磺胺类抗生素等）；④靶向细胞膜（多黏菌素等）；⑤前4种机制与抗生素诱导的应激反应协同作用，如DNA修复的SOS应答氧化应激等（β-内酰胺类抗生素等）。而针对上述作用机制，具有抗药性的细菌进化出了对应的抗生素抵抗机制[13-15]：①产生使抗菌药物失活的酶（针对β-内酰胺抗生素等）；②通过外排泵将抗生素泵出菌体外（针对红霉素等）；③改变原本对抗生素的作用靶位（针对β-内酰胺抗生素等）以及降低细菌细胞膜通透性、改变代谢通路等机制。面对具有多种耐药机制的超级细菌，传统抗生素的抗菌效果大大降低。

抗菌肽的抗菌机制主要通过细胞膜与细胞内两种途径实现[15-16]。抗菌肽的细胞内途径与传统的抗生素作用机制相似，主要通过与细菌细胞内的各种大分子相互作用而影响细胞功能来实现，如影响核酸复制、蛋白质合成、影响酶活性和细胞壁生成等[15-16]。

细胞膜途径是抗菌肽的主要抗菌途径，也是其与传统抗生素不同的特有途径。带有正电荷的抗菌肽与细菌带有负电荷的细胞膜通过静电吸附相结合，聚集在细菌细胞膜表面；抗菌肽两亲性结构中的疏水部分与细胞膜磷脂相互作用，破坏细菌的细胞膜，导致细胞死亡，从而实现抗菌。对于抗菌肽与细菌细胞膜的相互作用机制，目前还无法完全阐明，有多种常见的模型假说[16]，如桶-板模型、环-孔模型、地毯模型和聚集模型。在桶-板模型中[17]，随着抗菌肽在细胞膜表面聚集，其垂直插入脂质双分子层中，疏水部分朝外，亲水部分朝内形成通道，致使细胞内物质流出；环-孔模型与桶-板模型相似[17]，不同的是在环-孔模型中抗菌肽的疏水部分与细胞膜脂质层相结合，共同环绕着含有抗菌肽亲水部分的孔洞；在地毯模型中[18]，抗菌肽完全平行覆盖在细胞膜表面，随着抗菌肽不断聚集，细胞膜磷质层稳定性降低，最后完全被抗菌肽覆盖并破裂；在聚集模型中[19]，抗菌肽与细胞膜相互结合，覆盖细胞膜导致其破裂的同时也形成导致细胞内物质泄漏的孔道，这些孔道会进一步帮助抗菌肽进入细胞内，实现与传统抗生素分子相似的对核酸、蛋白质、酶等合成进行抑制的功能。无论是哪种模型，抗菌肽都能够使细胞膜穿透性大大增加，导致细胞溶解、胞内物质流出，引发细胞死亡。抗菌肽通过细胞膜途径引发细菌细胞死亡的生物活性与其结构密切相关，对抗菌肽的结构特点上的研究已经有了一定成果。

2 抗菌肽的结构-生物活性关系

抗菌肽的抗菌活性与其结构联系紧密，这种基于细胞膜损伤机制的抗菌活性为抗菌肽结构修饰优化提供了方向，其中在结构上对抗菌活性影响较大的几个因素包括电荷数、疏水性、螺旋度与两亲性等。

适当增加抗菌肽的正电荷数能够提高其抗菌活性[20]。绝大部分抗菌肽在中性pH下都为阳离子型，带正电荷，以此通过静电相互作用附着在细菌带负电的细胞表面。此外，正电荷还能够使抗菌肽与细胞膜脂多糖上的Ca2+、Mg2+结合位点结合，深入细胞膜内部，进一步破坏细胞膜结构[21]。细菌细胞的脂质膜作为抗菌肽作用的主要靶点，抗菌肽的疏水性对其与脂质膜的相互作用有着重要影响。通过引入疏水性残基，提高抗菌肽的疏水性，可以提高其抗菌活性。但过强的疏水性也会引发抗菌肽的自我聚集，降低其溶解度与抗菌活性[22]。大多数的抗菌肽有着α-螺旋的二级结构，抗菌肽在α-螺旋下能够更好地与细胞膜相结合，因此抗菌肽的螺旋度被认为与其抗菌活性有较强的相关性[22]。最后，两亲性是绝大多数抗菌肽具有的特性，其本身也是抗菌肽在电荷数与疏水性上取得平衡的结果，意味着抗菌肽既能够通过亲水域的静电作用吸附在细胞膜，也可以通过疏水域与细胞膜的相互作用渗入膜结构中，呈现抗菌活性。

3 抗菌肽的近期临床前结构优化研究进展

针对上述几个方面，通过优化抗菌肽的氨基酸序列能够改善其抗菌活性。此外，其他的化学修饰手段，如C端酰胺化、N端乙酰化、订合成环（利用小分子连接子，共价交联不同位置氨基酸的侧链，提高多肽稳定性等属性）、烷基链引入等方法[23-24]也被广泛应用于抗菌肽结构改造，以此达到高抗菌活性、提高多肽稳定性和降低溶血毒性等目的。下文将会介绍近年来通过疏水性、正电荷调整和其他化学修饰手段对抗菌肽进行优化的临床前研究进展。

3.1 氨基酸替换

对抗菌肽序列中的氨基酸进行替换、优化，以此调控多肽电荷、疏水性和二级结构等属性，从而实现更好的抗菌效果、更低的毒性或更高的稳定性，一直是抗菌肽临床前研究中的主要内容。Nibbering等[25]通过对人源抗菌肽LL37上C端的24个氨基酸序列进行随机替换和计算机活性预测，再将序列中的谷氨酰胺替换为阳离子的赖氨酸或精氨酸，提高其正电荷数和螺旋度，筛选合成了25个多肽衍生物，其中的抗菌肽SAAP148對多种多重耐药菌都具有良好的抗菌效果，其在50%血浆中对金黄色葡萄球菌的99.9%杀菌浓度LC99.9可达1.6～12.8 μmol/L，而改构原型LL-37的相应LC99.9则要大于204.8 μmol/L。SAAP148在血浆中的杀菌效果优于多种临床前和临床研究阶段的抗菌肽抑菌水平。

Deber等[26]从稀有的含连续多个阳离子氨基酸序列的天然抗菌肽出发，设计合成了含有“阳离子簇”的抗菌肽6K-F17，通过改换赖氨酸位置改变该多肽电荷分布，调整其两亲性，以探究两亲性对生物活性的影响。研究发现，虽然电荷分布更平均、两亲性更好的结构具有更高的抗菌活性，但对人体正常细胞的毒性也会随之增加，且抗酶解稳定性也会下降。N端含有连续6个赖氨酸，正电荷集中的6K-F17破坏细菌细胞膜能力强，对人细胞毒性低，有着更好的抗菌选择性。6K-F17对铜绿假单胞菌的MIC为3.1～25 μmol/L，而6个赖氨酸分散在多肽序列中的1K-5K抗菌肽的相应MIC则为25～>50 μmol/L。6K-F17也拥有更低的毒性和更好的多肽稳定性，在其40 μmol/L浓度下未观察到细胞溶血，且在血浆中保留24 h后抗菌肽含量依然无减少。

倪京满等[27]基于蜂毒抗菌肽anoplin设计合成了一系列疏水或亲水氨基酸替换的短链衍生物，对衍生物的生物活性与其正电荷、疏水性、两亲性和二级结构间的关系进行分析，发现这些衍生物的阳离子氨基酸与疏水氨基酸各自分布在α-螺旋二级结构的疏水面与亲水面上。作者总结了抗菌肽衍生物疏水性分别对革兰阴性和阳性菌抗菌活性的影响，筛选出了具有最高抗菌活性和低毒性的抗菌肽A-21，其对金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌的MIC95可达4～8 μmol/L，优于anoplin的256～512 μmol/L；同时A-21的最低溶血浓度MHC（抗菌肽引发10%人血红细胞溶血所需浓度）为134.38 μmol/L，溶血毒性较低。

单安山等[28]利用组氨酸侧链上亚胺pH敏感的质子化性质，以北非蝎子毒素中的抗菌肽AaeAP2a为模板，使用组氨酸替代赖氨酸设计并筛选出了具有酸性pH响应能力的抗菌肽F5。抗菌肽F5在pH 7.4的生理pH下对革兰阴性菌的杀菌能力微弱，MIC>64 μmol/L，而在pH 6.5的微酸性pH下相应抗菌活性明显增强，MIC可达2～16 μmol/L。此外，模板AaeAP2a在pH 7.4或6.5时MHC为16或2 μmol/L，而F5的MHC要大于128 μmol/L。 在脓肿环境下，F5可以有效杀伤处于酸性pH中的有害细菌，同时避免了对正常生理pH中有益共生菌的伤害。

3.2 线性肽成环

除了常规的氨基酸替换优化方法，将线性肽通过二硫键、订合等方法成环的手段在提高抗菌肽活性、稳定性等方面也有着广泛应用。赖仞等[29]以金环蛇毒中的抗菌肽衍生物cathelicidin-BF15为基础，使用色氨酸与赖氨酸替换原多肽中的所有苯丙氨酸、丝氨酸和亮氨酸，再插入半胱氨酸（Cys）成环，得到了具有保留强效抗菌活性、低溶血性的同时具有更高稳定性的抗菌肽ZY4，其对具有多重耐药性的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌引起的MIC可达0.8～4.0 μmol/L；而ZY4的MHC大于320 μg/mL，溶血毒性较低。此外，在血浆中保存10 h后，ZY4依然有91%保持结构稳定。

Walensky等[30]对天然抗菌肽蛙皮素II进行订合修饰，筛选了不同位点的i+4与i+7（将i与i+4或i与i+7位两个氨基酸的侧链连接）订合肽，对比其抗菌活性与红细胞溶血度，并对不同位点订合的抗菌肽疏水面进行分析，结合计算机辅助设计了抗菌肽筛选算法。通过算法确定在15位氨基酸订合后，再根据算法使用赖氨酸扫描在9位将丙氨酸替换为赖氨酸（A9K），使其在25 μg/mL浓度时的细胞溶血由13%降低到3%。之后作者再对已有订合肽在细胞膜上形成环-孔的具体机制进行了分析，以完善算法。作者进一步在Mag（i+4）15（A9K）的基础上，在1位氨基酸上增加一处订合以提高稳定性，最后对剩余位点氨基酸进行替换调整，通过算法帮助筛选出了具有最优的抗多重耐药菌活性、低溶血性、低毒性和高稳定性的双订合抗菌肽Mag（i +4）1，15 （A9K， B21A， N22K， S23K），其对铜绿假单胞菌的MIC可达1.56 μg/mL，而筛选前Mag2抗菌肽的相应MIC则大于50 μg/mL。

3.3 非氨基酸结构引入的化学修饰

向多肽中引入非氨基酸结构（如脂肪链等）来实现对抗菌肽性能的调控也是常用的方法之一。Kamysz等[31]将C2-C14烷基链或芳香环引入人源抗菌肽LL37的片段肽KR12-NH2的N端，以研究这种亲脂性修饰对抗菌活性和溶血性的影响。研究发现，在适当长度范围（C6-C12）内，N端烷基链修饰能够增加KR12-NH2的抗菌活性；但过长烷基链修饰（C14）的多肽会自组装为更大的聚集结构，反而会导致抗菌活性下降。经过对比，抗菌活性与溶血性取得平衡的最优结构为C8烷基链N端修饰的抗菌肽C8-KR12-NH2，其对于金黄色葡萄球菌的MIC可达2～4 μg/mL，而无烷基链修饰的Ac-KR12-NH2相应MIC大于256 μg/mL。同时，C8-KR12-NH2的MHC为64 μg/mL，而更长烷基链（C10-C14）修饰的KR12-NH2在相同浓度下则会引发85%～100%的细胞溶血。

3.4 单体多聚化

将单体抗菌肽二聚化或多聚化对扩展广谱性、提高抗菌活性和稳定性都有一定帮助，是一种有效的修饰手段。Wade等[32]通过二硫键、二甲苯或全氟苯连接Cys的方法，对先期研究中通过各种化学修饰手段得到的富脯氨酸抗菌肽Chex1-Arg20进行了二聚化。研究发现，使用四氟苯和八氟联苯连接的抗菌肽二聚体对多重耐药的鲍曼不动杆菌ATCC19606和FADDI-AB156的抗菌活性分别可达5 μg/mL和13.5 μg/mL，而Chex1-Arg20单体的相应抗菌活性为200 μg/mL和大于250 μg/mL。此外，Chex1-Arg20二聚体还被发现能够缓解细菌感染引发的炎症和提高宿主先天免疫。

3.5 抗菌肽与小分子抗生素偶联

将抗菌肽与小分子抗生素通过连接子进行共价偶联，利用抗菌肽靶向细菌细胞膜，再切断抗菌肽与抗生素间的共价连接释放活性小分子抗生素，能够同时结合小分子的细胞内杀菌功能与抗菌肽的广谱杀菌和针对多重耐药菌的高活性特点，获得比以上两者单纯联用更好的抗菌效果。Matsuzaki等[33]在爪蟾抗菌肽类似肽9P2-2和富脯氨酸抗菌肽oncocin两种多肽的C端与N端分别引入Cys，再通过二硫键或硫醚键与氨苄西林衍生分子共价连接，得到了可切断或不可切断的抗菌肽-小分子抗生素偶联分子。通过筛选发现，9P2-2在N端引入Cys后再通过二硫键连接氨苄西林衍生分子的偶联分子Amp-SS-9P2-2在抗革兰阴性菌的活性上有着显著提高。针对具有耐药性的鲍曼不动杆菌，Amp-SS-9P2-2的MIC可达2.5 μmol/L，低于单独使用氨苄西林时的320 μmol/L或单独使用9P2-2的10 μmol/L，而同剂量的氨苄西林与9P2-2单纯联用时MIC也只能达到10 μmol/L。

3.6 與其他材料聚合

将抗菌肽与其他材料相聚合，形成复合材料，可以突出抗菌肽的广谱抗菌优势，弥补其价格较昂贵、具有潜在毒性等缺陷，并同时实现其他材料的功能。程飚等[34]将抗菌肽cecropin通过端基与侧链的氨基与透明质酸（HA）的羧基通过缩合反应结合，再与氧化葡萄糖（ODEX）和富血小板血浆簇（PRP）通过席夫碱交联制成水凝胶ODEX/HA-AMP/PRP，用以帮助慢性感染的伤口愈合。这种包含抗菌肽在内的多组分水凝胶将各组分功能整合，在包裹伤口后可以缓慢释放抗菌肽和PRP，通过抗菌肽消杀细菌缓解炎症，通过PRP促进胶原增殖收缩和血管生成。在糖尿病伤口感染的小鼠模型中，ODEX/HA-AMP/PRP明显抑制了伤口处的细菌生长，处理3d时伤口处的铜绿假单胞菌和金黄葡萄球菌数量为106数量级，明显优于单纯纱布包扎处理情况下的108数量级；ODEX/HA-AMP/PRP也加快了伤口愈合速度，处理14 d的伤口面积减小为开始的10%左右，明显优于单纯纱布包扎处理情况下的50%。

3.7 引入納米载体

最后，使用纳米载体加载抗菌肽用于体内递送，能够克服抗菌肽的酶解不稳定性和脱靶毒性等缺点，从而提高抗菌肽的药代动力学与药效数据[35]。Lee等[36]使用DSPE-PEG修饰HnMc抗菌肽中Cys的侧链巯基，再将修饰后的DSPE-PEG-HnMc与PLGA-PEG以质量比2： 8共同自组装，形成了平均粒径为60 nm的HnMc纳米胶束。该纳米胶束中，疏水的PLGA与DSPE被包裹在胶束中心，亲水的PEG和HnMc抗菌肽分布在表面，因而可以主动靶向并破坏细菌的细胞膜；而同在胶束表面的PEG链则可以保护HnMc抗菌肽免受非特异性蛋白的吸附和降解。HnMc纳米胶束在0.1 mg/mL的浓度下也能够对耐药的铜绿假单胞菌和金黄葡萄球菌实现80%的生长抑制效果；HnMc纳米胶束的MHC为1 mg/mL，毒性较低；在耐药铜绿假单胞菌肺部感染的小鼠模型中，HnMc纳米胶束成功延长了小鼠的生存时间，在2.5 mg/kg剂量下生存时间由不经处理的6 d延长到16 d以上。

上述研究中所涉及的氨基酸序列及修饰手段总结可见表1。除了以上提及的氨基酸替换或化学修饰手段外，使用D构型或其他非天然氨基酸替换、聚乙二醇或糖基化修饰等方法均为抗菌肽结构优化常见思路[12，37]。

4 结论与展望

本文主要综述了抗菌肽作用机理、结构优化思路和近年来的临床前研究进展。相较于传统抗生素，抗菌肽主要针对细胞膜的作用机制在抗菌广谱性与抗多重耐药性上具有明显优势。通过多种修饰手段对抗菌肽进行结构优化的思路，如化学修饰和计算机辅助筛选等方法，在抗菌肽研究中已经得到了广泛应用。尽管上述结构优化手段在临床和产业化阶段应用还未全面推广，但随着针对耐药菌的新型抗菌药物需求的不断增大，具有广谱性、对耐药菌高活性和高生物相容性优点的抗菌肽将来必然会成为临床研究热点。

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