某医院2020—2021年CRE耐药性及碳青霉烯酶基因分析

刘志武 张甜甜 徐腾飞 陈琳

摘要：目的 分析该院近2年住院患者耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae， CRE）的臨床特征、耐药性及碳青霉烯酶基因型特点，为临床有效抗感染治疗及院感防控提供依据。方法 回顾性分析兰州大学第一医院2020年1月—2021年12月临床分离CRE327株。采用全自动时间飞行质谱检测系统（VITEK MS）及全自动细菌鉴定药敏分析仪（VITEK 2 Compact）进行菌株鉴定及药敏试验，药敏结果依据CLSI M100-S31判读；PCR方法检测blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM和blaOXA-485种碳青霉烯酶耐药基因。结果 2020年1月—2021年12月我院临床标本中分离出327株CRE，主要为肺炎克雷伯菌70.64%（231/327），其次为阴沟肠杆菌17.13%（56/327）和大肠埃希菌6.73%（22/327）；标本来源为痰50.76%（166/327）、血液13.15%（43/327）、分泌物10.09%（33/327）及尿液8.26%（27/327）等；科室分布主要是重症监护室41.9%（137/327）、儿科23.24%（76/327）及普外科14.37%（47/327）等。327株CRE对阿米卡星、庆大霉素、四环素、复方磺胺甲恶唑、左氧氟沙星和氨曲南耐药率分别是46.2%、61.80%、71.90%、74.60%、79.00%和81.4%。327株CRE中有317株（96.94%）检测到本研究关注的碳青霉烯酶耐药基因，其中168株菌携带blaKPC-2 基因（肺炎克雷伯菌124株、阴沟肠杆菌27株、大肠埃希菌10株、产酸克雷伯菌4株、弗劳地柠檬酸杆菌3株）；107株携带blaNDM-1基因（肺炎克雷伯菌75株、阴沟肠杆菌14株、大肠埃希菌11株、产酸克雷伯菌7株）；42株携带blaNDM-5基因（肺炎克雷伯菌25株、阴沟肠杆菌15株、弗劳地柠檬酸杆菌1株、奇异变形杆菌1株）；7株菌携带blaIMP-4基因（肺炎克雷伯菌3株，同时携带blaNDM-1基因，阴沟肠杆菌4株，同时携带blaNDM-5基因）。未检出blaOXA-48和blaVIM基因。结论 该院近两年对临床常用抗菌药物耐药形势严峻，CRE菌株以携带blaKPC-2和blaNDM-1基因为主，应加强碳青霉烯类抗菌药物控制和使用，预防CRE菌株感染和传播。

关键词：耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌；耐药性；耐药基因；流行特征

中图分类号：R978.1  文献标志码：A

Analysis of drug resistance and carbapenemase gene of carbapenem-resistant

Enterobacteriaceae in a hospital from 2020 to 2021

Liu Zhiwu1， Zhang Tiantian2， Xu Tengfei1， and Chen Lin3

（1 Department of Clinical Medical Laboratory， the First Hospital of Lanzhou University， Lanzhou 730000;

2 The First School of Clinical Medicine， Lanzhou 730000;

3 Department of Infectious Disease， the First Hospital ofLanzhouUniversity， Lanzhou 730000）

Abstract Objective The clinical characteristics， drug resistance and carbapenemase genotype of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae （CRE） in hospitalized patients in the past two years were analyzed to provide evidence for effective clinical anti-infection treatment and nosocomial infection prevention and control. Methods Analyze retrospectively 327 CRE isolates from the First Hospital of Lanzhou University from January 2020 to December 2021 were analyzed retrospectively. Strain identification and drug sensitivity test were carried out by VITEK MS and VITEK 2 Compact. The drug sensitivity results were interpreted according to CLSI M100-S31. PCR was used to detect five carbapenemase resistance genes， including blaKPC， blaNDM， blaIMP， blaVIM and blaOXA-48. Results A total of 327 CRE strains were isolated from clinical specimens in our hospital from January 2020 to December 2021. The 327 CRE strains were mainly Klebsiella pneumoniae（70.64%， 231/327）， followed by Enterobacter cloacae（17.13%，56/327） and Escherichia coli（6.73%，22/327）. 50.76% （166/327）， 13.15%（43/327）， 10.09% （33/327） and 8.26% （27/327） were from sputum， blood， secretions and urine， respectively. 41.9% （137/327）， 23.24% （76/327） and 14.37% （47/327） were from the intensive care unit， pediatrics and general surgery. The drug resistance rates of 327 CRE strains to amicacin， gentamicin， tetracycline， cotrimoxazole， levofloxacin and amtronam were 46.2%， 61.80%， 71.90%， 74.60%， 79.00% and 81.4%， respectively. Among the 327 CRE strains， 317 strains （96.94%） containing carbapenase resistance genes in this study were detected. 168 strains carried blaKPC-2 （124 strains of Klebsiella pneumoniae， 27 strains of Enterobacter cloacae， 10 strains of Escherichia coli， 4 strains of Klebsiella acidophilus and 3 strains of Fraudiella citrate）; 107 strains carried blaNDM-1 （75 strains of Klebsiella pneumoniae， 14 strains of Enterobacter cloacis， 11 strains of Escherichia coli and 7 strains of Klebsiella acidophilus）; 42 strains carried blaNDM-5 （25 strains of Klebsiella pneumoniae， 15 strains of Enterobacter cloacis， 3 strains of Citrate bacteria freudi and 1 strain of Proteus mirae）. 7 strains carried blaIMP-4 （3 strains of Klebsiella pneumoniae carried blaNDM-1， and 4 strains of Enterobacter cloacis carried blaNDM-5）. The genes blaOXA-48 and blaVIM were not detected. Conclusion In recent two years， there is a serious situation of antimicrobial resistance to commonly used clinical antibiotics in our hospital. CRE strains mainly carry blaKPC-2 and blaNDM-1， and thus the control and use of carbapenems antibacterial drugs should be strengthened to prevent the infection and spread of CRE strains.

Key words Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae; Drug resistance; Drug resistance gene; Epidemiological characteristics

肠杆菌科细菌是造成院内感染的常见病原菌，主要引起呼吸、泌尿及血液循环系统等器官感染。碳青霉烯类药物是治疗肠杆菌科重症感染最常用最广谱的抗生素之一，国家卫健委高度重视其临床合理使用问题[1]。近年来，随着抗菌药物大量使用，临床实验室对耐药菌分离率逐年上升，尤其CRE菌株检出率和耐药率尤为严重，给临床的抗感染治疗带来新的挑战，引起了医学界的高度关注[2-3]。CRE最主要耐药机制是产生碳青霉烯酶[4]，为探讨CRE菌株耐药特征及机制，本研究收集我院近两年微生物实验室分离临床CRE菌株，回顾性分析临床特征及耐药性，检测碳青霉烯酶主要基因型，为临床医生用药选择和院感防控提供指导依据。

1 材料与方法

1.1 菌株选择

选择兰州大学第一医院2020年1月—2021年12月住院患者送检各类标本（痰、血液、尿液、分泌物、胆汁及胸腹水等）中分离的CRE菌株，剔除同一患者相同部位分离到的重复菌株。

1.2 仪器和试剂

VITEK MS全自动时间飞行质谱检测系统、VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定药敏分析仪及配套GN334药敏卡、哥伦比亚血平板和MH平板（郑州安图公司）、K-B法药敏纸片（英国Oxoid公司）、DNA marker DL1000（TaKaRa公司）、Taq DNA预混酶（TaKaRa公司）、PCR扩增仪（杭州博日科技有限公司）、ALPEP凝胶成像仪（美国通用电气）、电泳仪（北京市六一仪器厂）、琼脂糖（北京智杰方远科技有限公司）、引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1  菌株鉴定与药敏试验

严格按照第4版《全国临床检验操作规程标准》执行病原菌鉴定和药敏试验[5]，采用全自动时间飞行质谱检测系统（VITEK MS）及全自动细菌鉴定药敏分析仪（VITEK 2 Compact）进行菌株鉴定及药敏试验。药敏试验涉及的抗生素包括：庆大霉素、阿米卡星、四环素、左氧氟沙星、复方磺胺甲恶唑、氨曲南、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林克拉维酸酯、头孢哌酮/舒巴坦、头孢唑林、头孢呋辛、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、头孢西丁、厄他培南、亚胺培南及美罗培南。使用纸片扩散法对厄他培南、亚胺培南和美罗培南结果进行复核，药敏结果按照《CLSI M100-S31标准》判读，质控菌株采用大肠埃希菌ATCC25922。

1.3.2 碳青霉烯酶基因检测

根据文献碳青霉烯酶blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM和blaOXA-48基因型引物序列[6]，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成（见表1）。采用煮沸法提取DNA模板。PCR扩增体系总体积为25 ?L、Taq DNA MIX酶10 ?L、DNA模板3 ?L及上下游引物各1 ?L，无菌纯水补足至25 ?L。扩增检测碳青霉烯酶耐药基因，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳成像观察结果，试验过程设阴阳性对照，对阳性扩增片段进行测序测定，测序使用标准双脱氧链终止法流程，测序结果利用美国国家生物技术中心的基本局部匹配查询工具进行比对确认并分型。

2 统计分析

使用WHONET5.6软件和SPSS21.0软件进行统计学处理和分析，计数资料使用例数和百分率表示，构成比的分析χ2检验，以P＜0.05时差异有统计学意义。

3 结果

3.1 临床资料

我院2020年1月—2021年12住院患者送检标本中分离出327株CRE中，男性占65.14%（213/327），女性占34.86%（114/327）；患者年齡分布情况：＜18岁占23.55%（77/327），18～60岁占41.90%（137/327），＞60岁占34.56%（113/327）；菌株科室分布情况：重症监护室41.90%（137/327），儿科23.24%（76/327），普外科14.37%（47/327），血液科2.75%（9/327）及其他科室17.74%（58/327）；菌株标本来源情况：痰50.76%（166/327），血液13.15%（43/327），分泌物10.09%（33/327），尿液8.26%（27/327），腹水5.5%（18/327）及其他标本12.24%（40/327）；菌株分布：肺炎克雷伯菌占70.64%（231/327），阴沟肠杆菌占17.13%（56/327），大肠埃希菌占6.73%（22/327），产酸克雷伯菌占3.67（12/327）等，见表2。

3.2 CRE菌株耐药情况

327株CRE对阿米卡星、庆大霉素、四环素、复方磺胺甲恶唑、左氧氟沙星和氨曲南的耐药率分别是46.2%、61.80%、71.90%、74.60%、79.00%和81.4%，其余被检测抗菌药物耐药率均高于98%，其中11种抗菌药物耐药率为100%，见表3。

3.3 碳青霉烯酶基因检测结果

327株CRE菌株中有317株（检出率96.94%）携带本研究关注的碳青霉烯酶耐药基因，经测序确认，168株菌携带blaKPC-2基因（肺炎克雷伯菌124株、阴沟肠杆菌27株、大肠埃希菌10株、产酸克雷伯菌4株及弗氏柠檬酸杆菌3株），107株携带blaNDM-1基因（肺炎克雷伯菌75株、阴沟肠杆菌14株、大肠埃希菌11株及产酸克雷伯菌7株），42株携带blaNDM-5基因（肺炎克雷伯菌25株、阴沟肠杆菌15株、弗劳地枸橼酸杆菌1株及奇异变形杆菌1株），7株菌携带blaIMP-4基因（肺炎克雷伯菌3株，同时携带blaNDM-1基因，阴沟肠杆菌4株，同时携带blaNDM-5基因）。未检出blaOXA48和blaVIM基因，检测到的耐药基因分布结果如表4所示。

4 讨论

肠杆菌科细菌是临床微生物实验室分离率最高病原菌之一，也是引起感染的常见病原体，碳青霉烯类抗菌药物是治疗该类耐药菌引起感染的首选药物，甚至在过去的10年中，碳青霉烯类药物被认为是治疗耐药革兰阴性菌感染的最后一道防线[7]。近年以来，CRE检出率呈逐年升高趋势[8]，CRE所引起的严重感染或无症状定植成为临床抗感染治疗的难题[9-11]。因此关注CRE引起医院内感染现象，对院感防控和临床抗感染治疗以及降低CRE感染患者的死亡风险有积极意义[12]。

本研究结果显示2020—2021年，我院327株CRE的性别分布中，男性占65.14%，女性占34.86%，这与国内其他医院文献报道类似[12]，我们推测男性患者CRE病原菌易感的因素可能与吸烟、饮酒、职业暴露及生活习惯有关，但有待进一步研究确认；我院分离到的CRE菌株患者年龄分布主要集中在儿童及老年患者。而科室分布则集中在重症监护室（包括儿科、门急诊和心内科重症监护室）。以上年龄和科室分布情况的成因可能为：老幼患者身体状况较差，身体抵抗力和免疫力均较低。尤其是老年患者常伴有较严重的基础性疾病，住院时间长，接受气管切开和留置导尿管等侵入性治疗较多往往同时合并多脏器感染，并且长时间使用广谱抗菌药物，甚至碳青霉烯类抗菌药物大量使用，这些均为CRE易感因素[13]。重症监护室CRE检测出率较高的主要原因重症监护室（包括儿科、门急诊和心内科等重症监护室）是我院重点专科，病床多，病源量大、收治病种复杂等，患者住院周期长，尤其碳青霉烯类抗菌药物使用，治疗性的侵入操作多等。

从327株CRE菌株标本来源分析，呼吸道标本是我院CRE菌株来源的主要标本，与文献[14]报道基本一致，呼吸道标本中分离率高的原因一方面是标本送检量较大，另一方面和患者气管插管、切开，机械通气，呼吸机使用等因素均为肺部感染的易感因素。其次是血液标本中CRE分离率较高，这可能是因为侵入性操作引起的，应该引起足够的关注。

近年来，耐药监测网CHINET报告显示CRE分离率逐年升高。例如肺炎克雷伯菌2005年对美罗培南和亚胺培南的耐药率从2.9%和3.0%上升到2019年的26.8%和25.3%，升高了大约9倍左右[15]。本研究显示，我院2020—2021年分离的327株CRE中肺炎克雷伯菌占70.64%，其次为阴沟肠杆菌占17.13%、大肠埃希菌占6.73%、产酸克雷伯菌占3.67%等，这和相关文献报导相近[14]，提示耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯菌大量存在，需引起临床和院感相关部门的高度重视。药敏试验结果显示，本院分离的CRE菌株对临床常用的β-内酰胺类抗菌药物以及酶复合制剂等耐药在90%～100%之间。但对阿米卡星耐药率相对较低，这给临床治疗提供了一线希望。阿米卡星具有肾毒性、耳毒性等副作用，但仍然是临床CRE治疗的选择药物，特别是在肺炎克雷伯菌感染时被用作一线治疗药物[16]。该药通常不用作单药治疗CRE感染，而与替加环素、多黏菌素及碳青霉烯类等联合疗效优于单药治疗[17]。我国细菌耐药监测网学术委员会专家建议，临床对CRE治疗，应根据敏感或中介的药敏结果联合用药。如替加环素联合氨基糖苷、多黏菌素或磷霉素，酶抑制剂复合抗菌药物联合多黏菌素、氨基糖苷类和氟喹诺酮类等，治疗时根据药敏结果调整用药方案[18]。

CRE对碳青霉烯类药物耐药机制主要包括以下几种：①产生碳青霉烯酶，常见的碳青霉烯酶耐药基因是KPC和NDM；②ESBL和AmpC酶高度表达同时合并膜孔蛋白缺失或表达降低；③碳青霉烯药物作用靶位青霉素结合蛋白（penicillin binding protein，PBP）改变等[19-20]。本研究主要关注5种碳青霉烯酶耐药基因，包括blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM和blaOX48。blaKPC属于Ambler分子结构分类的A类酶，是近些年最流行的耐药基因，可水解多种β-内酰胺类抗菌药物，blaKPC亚型中已发现的有10多种，但目前常见的是blaKPC-2和blaKPC-3型，我院近两年CRE菌株测序结果主要为blaKPC-2型，与国内其他地区报道一致[14]；blaNDM和blaIMP耐药基因属于B类金属酶，尤其blaNDM基因型曾暴发流行[21]。本研究显示，我院327株CRE中有317株携带本研究关注的碳青霉烯酶耐药基因中的一种或多种，其中占首位的是blaKPC-2基因。其次为blaNDM-1基因、blaNDM-5基因及blaIMP-4基因，未检出blaOXA48和blaVIM基因。对于本院分离的碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌来讲，耐药基因型为blaKPC-2的占53.6%，blaNDM基因（blaNDM-1与blaNDM-5）占43.2%，blaIMP-4基因占1.2%。可见本院结果中碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌的blaNDM基因占比高于陈东科等报道[22]，也高于两项全国性的调查，这两項调查中碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌blaNDM基因的占比分别为18.6%和15.0%[23-24]。这种差异可能与菌株收集及地区差异均有关系。耐药基因分析提示我院CRE对碳青霉烯酶耐药基因携带率较高，由于耐药基因可以通过转座子、质粒等水平传播，可能产生CRE逐年增高的风险，这给院感防控和临床抗感染治疗带来巨大挑战。

总之，CRE耐药问题已成为全球公共卫生关注的重点，院感、临床科室和微生物实验室应加强沟通和合作，积极送检标本，主动筛查CRE的干预措施，切断传播途径，医务人员树立正确手卫生观念，临床根据药敏结果合理精准的治疗，降低CRE的感染和流行。

参 考 文 献

国家卫生健康委办公厅. 国家卫生健康委办公厅关于持续做好抗菌药物临床应用管理工作的通知[EB/OL]. （2020-07-20）[2021-09-18]. http： //www. gov. cn/zhengce/zhengceku/2020-07/24/content_5529693. htm.

李鑫， 杨继勇. 耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌分布与流行特征研究进展[J]. 中华微生物学和免疫学杂志， 2019， 39（4）： 306-310.

Saccd N K， Alkhawaja S， Azam N F A E M， et al. Epidemiology of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae in a tertiary care center in the kingdom of bahrain[J].  J Lab Physicians， 2019， 11（2）： 111-117.

Tangden T， Giske C G. Globaldissemination of extensively drugresistant carbapenemase-producing Enterobacteriaceae： Clinical perspectives on detection， treatment and infection control[J]. J Intern Med， 2015， 277（5）： 501-512.

尚红， 王毓三， 申子瑜， 等. 全国临床检验操作规程[M]. 北京： 人民卫生出版社， 2015： 574-625.

Poirel L， Walsh T R， Cuvillier V， et al. Multiplex PCR for detection of acquired caebapenemase genes[J]. Diagn Microbiol Infect Dis， 2011， 70（1）： 119-123.

黄晓琳， 李明， 范晓怡， 等. 2015—2019年我院肺炎克雷伯菌的感染特征与耐药机制[J]. 中国抗生素杂志， 2021， 46（5）： 468-473.

张颖， 何卫， 胡云双， 等. 某医院碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌临床分布特点及耐药性分析[J]. 中国卫生检验杂志， 2020， 30（18）： 2197-2199.

Doi Y. Treatment options for carbapenem-resistant Gram negative bacterial infections[J]. Clin Infect Dis， 2019， 69（Suppl7）： S565-S575.

Trecarichi E M， Tumbarello M. Therapeutic options for carbapenem-resistant Enterobacteriaceae infections[J]. Virulence， 2017， 8（4）： 470-484.

Durante-Mangoni E， Andini R， ZampinoR. Management of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae infections[J]. Clin Microbiol Infect， 2019， 25（8）： 943-950.

王磊， 关月， 崔佳， 等. 陕西某三甲医院558株耐碳青霉烯类肠杆菌临床分布及耐药性[J]. 中华医院感染学杂志， 2021， 31， （23）： 3521-3526.

由晓颜， 孔繁荣， 苏维奇， 等. 耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的临床分布特点及耐药性分析[J]. 中国卫生检验杂志， 2018， 27（4）： 601-603.

郭普， 乔艳， 李静， 等. 2016—2018年某医院CRE临床分布、耐药性及碳青霉烯酶基因检测[J]. 中国抗生素杂志， 2020， 45（11）： 1139-1143.

胡付品， 郭燕， 朱德妹， 等. 2019年CHINET三级医院细菌耐药监测[J]. 中国感染与化疗杂志， 2020， 20（3）： 233-243.

Wang H， Min C， Li J， et al. Characterization of fosfomycin resistance and molecular epidemio-logyamong carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains from two tertiary hospitals in China[J]. BMC Microbiol， 2021， 21（1）： 109.

Chen J， Wang D， Ding Y， et al. Molecular epidemiology of plasmid-mediated fosfomycin resistance gene determin antsin Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae isolates in China[J]. Microb Drug Resist， 2019， 25（2）： 251-257.

韩仁如， 胡付品. 耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌中OXA-48家族碳青霉烯酶分子流行病学研究进展[J]. 中国感染与化疗杂志， 2019， 19（6）： 687-690.

Patel G， Bonomo R A. Status report on carbapenemases： challenges and prospects[J]. Expert Rev Anti Infect Ther， 2011， 9（5）： 555-570.

Falagas M E， Lourida P， Poulikakos P， et al. Antibiotic treatment of infections due tocarbapenem-resistant Enterobacteriaceae： Systematic evaluation of the available evidence[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2014， 58（2）： 654-663.

Hamzaoui Z， Ocampo-Sosa A， Maamar E， et al. An Outbreakof DM-1-Producing Klebsiella pneumoniae， associated with OmpK35 and OmpK36 porin loss intunisia[J]. Microb Drug Resist， 2018， 24（8）： 1137-1147.

陳东科， 周海健. 耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌种群结构和耐药机制研究[J]. 中国抗生素杂志， 2018， 43（5）： 507-512.

Zhang R， Liu L， Zhou H， et al. Nationwide surveillance of clinical carbapenem-resistant Enterobacteriaceae （CRE）strains in China[J]. EBioMedicine， 2017， 19： 98-106.

Zhang Y， Wang Q， Yin Y， et al. Epidemiology of carbapenemresistant Enterobacteriaceae infections： Report from the China CRE network[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2018， 62（2）： e01882-17.