蜡梅花药材UPLC特征图谱及黄酮类成分含量测定研究

钟春琳，何嘉莹，邱韵静，林晗，潘礼业，梁永新，李国卫，兰小勇，陈向东

（广东一方制药有限公司广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528200）

蜡梅花收载于《中华人民共和国卫生部药品标准：中药材第1 册[1]、《江苏省中药材标准》[2]和湖北省中药材质量标准[3]，标准规定蜡梅花为蜡梅科植物蜡梅Chimonanthus praecox（L.）Link 的干燥花蕾。1~3 月采摘，晒干或烘干。具有解暑生津的功效，常用于热病烦渴、胸闷、咳嗽。蜡梅花的化学成分主要包含有龙脑、桉油精、洋蜡梅碱、蜡梅苷、亚油酸、油酸等挥发性成分，也含有生物碱、黄酮类、香豆素类、甾体类等成分；叶中含有蜡梅碱、氢氰酸等成分[4]。研究表明蜡梅花黄酮类成分具有抗氧化活性[5]。现行标准中，《湖北省中药材质量标准（2018 年版）》仅收载了其显微鉴别、薄层鉴别，《江苏省中药材标准（2016 年版）》收载了其显微鉴别、薄层鉴别、芦丁和槲皮素质量分数测定项。有相关研究也报道了其芦丁的质量分数测定方法[6]和槲皮素质量分数测定方法[7]，但采用的是高效液相色谱法，分析时间较长，且不能同时测定芦丁和槲皮素质量分数。由于中药有效成分具有多样性及复杂性，单纯地检测某一成分缺乏一定的专属性，同时对中药材质量的评价稍显偏颇。特征图谱作为控制中药质量的鉴别手段，结合多指标成分定量分析，不但可鉴别产品真伪，而且可控制主要特征峰的质量分数，是全面控制中药质量的可行模式[8]。目前尚无文献报道蜡梅花特征图谱或指纹图谱的研究。

本研究采用UPLC 法建立蜡梅花药材的特征图谱，同时测定黄酮类成分芦丁和槲皮素的质量分数，可综合控制和评价蜡梅花药材的质量。

1 仪器与材料

Thermo Vanquish 型超高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司）；Waters Cortecs T3（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）色谱柱；Mettler XP-26型百万分之一天平，ME204E 型万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q 型超纯水净化系统（美国Millipore 公司）；电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯；水为Mili-Q 超纯水；其余试剂为分析纯。芦丁（批号：100080-202012，质量分数91.6%）、槲皮素（批号：100081-201610，质量分数99.1%）、山柰酚（批号：110861-202013，质量分数93.2%）对照品由中国食品药品检定研究院提供；17 批药材经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定，为蜡梅科植物蜡梅Chimonanthus praecox（L.）Link 的干燥花蕾，来源见表1。

表1 17批蜡梅花药材的来源信息Table 1 Origins of 17 batches of Chimonanthus praecox Flower

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Waters Cortecs T3（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）色谱柱，流速为0.3 mL/min；柱温为35 ℃；进样量为1 μL，检测波长为355 nm；以甲醇（A）-0.2%磷酸（B）为流动相，梯度洗脱（0~3 min，25%A→25%A；3~4 min，25%A→27%A；4~13 min，27%A→29%A；13~14 min，29%A→36%A；14~30 min，36%A→42%A）。

2.2 对照品溶液的制备

分别取芦丁、槲皮素、山柰酚对照品适量，精密称定，加60%（体积分数，下同）甲醇分别制成质量分数为99.11、59.71、21.08 μg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

本品粉末（过3号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 特征图谱的建立及评价

2.4.1 精密度试验 取同一供试品溶液（S1），按“2.1”项下的色谱条件连续进样6 次，以芦丁为参照峰，计算5 个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取同一供试品溶液（S1），按“2.1”项下的色谱条件，分别于0、2、6、8、10、12、18、24 h 进样测定，以芦丁为参照峰，计算5 个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD 均小于3%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 样品粉末约0.5 g（S1），平行6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，以芦丁为参照峰，计算5 个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD 均小于3%，表明方法重复性良好。

2.4.4 耐用性试验 采用33~37 ℃柱温、0.28~0.32 mL/min 流速对特征图谱中5 个特征峰的分离度、相对保留时间和相对峰面积进行考察，发现影响均不大，表明耐用性良好。考察了Waters Cortecs T3（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 µm）、Waters BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱对特征图谱的影响，发现Agilent ZORBAX SB-C18和Waters Cortecs T3 色谱柱对5 个共有峰分离度较好，峰分布均匀。

2.4.5 特征图谱分析与评价

2.4.5.1 特征图谱的建立 精密称取17 批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。将17 批药材特征图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.0 版）”中，选择S1 蜡梅花的色谱图作为参照图谱，以平均数法作为对照图谱生成方式，设定时间窗宽度为0.1 min，多点校正后，在全谱峰匹配模式下生成5 个共有峰，并生成对照图谱R，见图1。

图1 17批蜡梅花特征图谱和对照图谱叠加图Figure 1 Superimposed chromatograms of characteristic chromatograms and control chromatograms of 17 batches of Chimonanthus praecox Flower

根据对照品指认，确定了蜡梅花特征图谱中峰2、4、5 分别为芦丁、槲皮素、山柰酚。见图2。

图2 蜡梅花特征图谱和对照品HPLC图Figure 2 Characteristic chromatogram of Chimonanthus praecox Flower and HPLC chromatograms of reference substance

2.4.5.2 相似度评价 在“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.0 版）”中，系统根据各批次样品色谱图的共有模式生成对照图谱R，计算出S1~S17 蜡梅花药材特征图谱与对照图谱R 的相似度，各批次药材与对照图谱之间的相似度均大于0.90，表明各批次药材的相似度良好。见表2。

表2 17批蜡梅花药材的相似度测定数据Table 2 Similarity measurement data of 17 batches of Chimonanthus praecox Flower

2.5 含量测定

2.5.1 线性关系考察 分别精密量取5 份质量浓度为495.5 μg/mL 的芦丁对照品储备液1 mL，分别置2、5、10、20、50 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，分别制成每1 mL 含芦丁247.8、99.11、49.55、24.78、9.911 μg 的芦丁对照品溶液。分别精密量取5 份质量浓度为306.417 μg/mL 的槲皮素对照品储备液1 mL，分别置2、5、10、25、50 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，分别制成每1 mL 含槲皮素153.2、61.28、30.64、12.26、6.128 μg 的对照品溶液。分别精密吸取芦丁对照品储备液、上述5 种不同质量浓度的对照品溶液1 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标（y），对照品质量浓度为横坐标（x），建立线性回归方程。得到芦丁标准曲线为y1=0.093 2x1-0.055 5，r1=0.999 9；槲皮素标准曲线为y2=0.179 9x2-0.313 3，r2=1.000 0，芦丁、槲皮素分别在9.911~495.5、6.128~306.4 μg/mL 范围内，质量浓度与峰面积峰面积线性关系良好。

2.5.2 精密度试验 取同一份供试品溶液（批号：S1），按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6 次，记录色谱图。测得芦丁和槲皮素峰面积RSD 值分别为0.30%、1.15%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 取同一批供试品溶液（批号：S1），在室温下于配置后0、2、4、6、8、12、18、24 h 分别按“2.1”项下色谱条件进样测定，测得芦丁和槲皮素峰面积RSD 值分别为0.11%、0.60%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.4 重复性试验 精密称取供试品（批号：S1）适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，平行6 份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，测得芦丁和槲皮素质量分数RSD 值分别为1.59%、0.63%，表明该方法重复性良好。

2.5.5 加样回收率试验 分别称取芦丁、槲皮素对照品27.975、14.911 mg，置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶液制成每1 mL 含芦丁2.563 mg、槲皮素1.478 mg的对照品储备液。精密吸取上述储备液1 mL 于具塞锥形瓶中，平行操作6 份，挥干溶剂；再分别取蜡梅花药材粉末（批号：S1）适量，分别取约0.25 g置于上述6 个锥形瓶中，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录芦丁和槲皮素的峰面积，计算芦丁和槲皮素加样回收率，结果见表3、4，表明方法加样回收率良好。

表3 蜡梅花芦丁加样回收率试验结果Table 3 The results of rutin accuracy of Chimonanthus praecox Flower(n=6)

表4 蜡梅花槲皮素加样回收率试验结果Table 4 The results of quercetin accuracy of Chimonanthus praecox Flower(n=6)

2.5.6 样品测定 分别取17 批蜡梅花药材适量，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果见表5。

表5 17批蜡梅花中2种成分的质量分数测定结果Table 5 Results of mass fraction determination of 2 components in 17 batches of Chimonanthus praecox Flower(n=2) w/(mg·g-1)

2.5.7 聚类分析 以17批蜡梅花样品芦丁和槲皮素质量分数测定结果为变量导入SPSS 22.0 软件进行系统聚类，采用组间平均数联结法，以余弦距离作为样品相似度的距离公式，结果见图3。同一产地不能聚为一类，说明芦丁和槲皮素质量分数与产地相关性不大。

图3 17批药材样品聚类分析结果Figure 3 Cluster analysis results of 17 batches of samples

3 讨论

本研究建立了蜡梅花药材的UPLC 特征图谱，分析时间短、分离度良好、基线平稳，标定共有峰5个，指认峰2、4、5分别为芦丁、槲皮素、山柰酚。各批次药材与对照图谱R之间的相似度均大于0.90。

现代药理研究认为，蜡梅花的主要活性成分为黄酮类成分，其中芦丁、槲皮素和山柰酚为蜡梅花中质量分数较高的黄酮类成分，具有抗氧化、抗抑郁及保护受损器官等作用[9-10]。本法基于特征图谱信息量丰富，选择测定波长为355 nm，且蜡梅花中山柰酚原型成分质量分数较低、响应低，与芦丁和槲皮素质量分数差异较大，不宜采用同法测定，故本研究仅测定芦丁和槲皮素质量分数。17批不同产地蜡梅花药材中芦丁、槲皮素质量分数均值分别为12.21、4.07 mg/g，根据聚类分析结果，同一产地不能聚为一类，说明蜡梅花药材黄酮类成分（芦丁和槲皮素）质量分数与产地相关性不大。目前已有文献报道测定蜡梅花中芦丁的质量分数均值为2.37 mg/g[6]，与本研究测定结果差异较大，可能原因为文献研究药材为素心蜡梅Chimonanthus praecox（L.）Link var. Concolor Makino，而本文研究药材为蜡梅Chimonanthus praecox（L.）Link。还有文献报道[7]测定云南产3 批蜡梅花中槲皮素质量分数均值为0.36 mg/g，研究样品数量较少，代表性不足。而本研究采用UPLC 法测定蜡梅花药材特征图谱，同时测定17批不同产地样品中芦丁和槲皮素质量分数，为蜡梅花药材的采购和质量评价提供了参考。