鸡矢藤醇提物联合抗生素对MRSA的体外抑菌效果研究

蒲俏虹，陈至里，杨彤，周莹，张少俊，林淑健，刘劼，黄心照，彭拓华

（广东省生物制品与药物研究所，广东 广州 510440）

耐药菌感染已成为医疗机构面临的一个严峻挑战，严重威胁人类健康。其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是临床上常见的耐药菌，全国细菌耐药监测网及CHINET的监测资料显示多重耐药菌MRSA 的感染率在50%以上，且ICU、烧伤病房中，感染有加重的趋势[1-2]。由于MRSA 具有多重耐药性，临床中面临治疗难度高、死亡率高等困难，因此成为世界范围内耐药性检测的重点对象[3]。目前，临床上可用于治疗MRSA 的药物非常有限，一线药物主要有万古霉素、替考拉宁和去甲万古霉素等抗生素，而这些药物价格昂贵，且具有耳毒性和肾毒性大等缺点，临床用药时需谨慎选择[4-5]。因此，开发更多经济有效的抗MRSA 药物是目前迫切需要解决的问题。近年来，已发现多种中药及相关活性成分具有显著抗耐药菌作用[6-9]，从中药中开发抗菌药物将形成一个新的研究领域。

鸡矢藤性平，味甘、微苦，具有祛风利湿、止痛解毒、活血消肿的功效及镇痛、抗炎等药理作用，临床上多用于多种疼痛和胃肠道疾病的治疗，除此之外，还可用于带状疱疹、结核、痈疮肿毒和蛇虫咬伤等疾病的治疗，具有很高的药用价值[10-13]。已有研究报道鸡矢藤对金黄色葡萄球菌有抑制作用[14]。为了探讨鸡矢藤醇提物是否对MRSA 有抑菌作用，以及评估鸡矢藤醇提物与抗生素联用是否具有增强抗生素的抑菌效果，本文通过牛津杯法、微量稀释法评价鸡矢藤醇提物对MRSA 的抑菌效果，并通过微量棋盘法探究鸡矢藤醇提物是否可与常用抗生素产生协同抗菌作用，为鸡矢藤的抗耐药菌应用提供参考。

1 材料与仪器

1.1 药物及样品

1.1.1 中药材 鸡矢藤Paederia scandens（Lour.）Merr购于佛山市中天中药饮片有限公司，由广东省生物制品与药物研究所彭拓华主任中药师鉴定为正品。

1.1.2 样品 称取100 g 鸡矢藤药材粉末（过2 号筛），加入10 倍体积60% 乙醇，45 ℃超声提取90 min，期间搅拌多次；过滤后弃去滤渣，滤液经旋转蒸发仪浓缩后加水定容至100 mL，制成质量浓度为1 g/mL 的提取物，过滤除菌后-30 ℃冷藏保存备用。

1.1.3 抗生素 盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液（海力健，批号80120051202）；硫酸多黏菌数B（Aladdin，批号J2126657）；左氧氟沙星（Aladdin，批号J2122423）；硫酸庆大霉素（Aladdin，批号H2106059）；万古霉素（Aladdin，批号H2125431）；氨苄青霉素（Aladdin，批号E2011092）。

抗生素前期处理：取适量的左氧氟沙星和氨苄青霉素，分别采用生理盐水稀释混匀至终质量浓度为2 mg/mL 的工作液。取适量的万古霉素，采用生理盐水稀释混匀至终质量浓度为0.2 mg/mL 的工作液。取适量庆大霉素，采用生理盐水稀释混匀至终质量浓度为1 mg/mL的工作液。取适量多黏菌数B，采用生理盐水稀释混匀至终质量浓度为10 mg/mL的工作液。

1.2 菌株

1.2.1 试验菌株 56 株MRSA 临床分离株由中山大学附属第三医院岭南医院馈赠。上述菌株由该医院2020 年1－12 月从患者送检的各种标本中分离所得（排除污染和同一患者相同部位多次分离的菌株），并经VITEK 2 Compact检定。

1.2.2 质控菌株 金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923（环凯生物，批号：G0070 DX）；MRSA 标准菌株ATCC43300（广东省微生物菌种保藏中心，批号：20221109）。

1.3 试剂

MH琼脂（环凯生物，20220723）；MH肉汤培养基（环凯生物，20220804）；TTC（环凯生物，220320P10）；盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液（海力健，批号80120051202）。按照说明书的要求配置MH琼脂培养基、营养肉汤培养基，调节pH 值至7.2±0.1，121 ℃15 min高压灭菌，4 ℃冰箱保存备用。

1.4 主要仪器

SQP 电子天平（Sartorius，德国）；Heratherm IGS400 恒温培养箱（Thermo Fisher Scientific，美国）；HeraSafe KS15 生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，美国）；Nano Quant 酶标仪（TECAN，瑞典）；SQ510 C 高压蒸汽灭菌锅（YAMATO，日本）；GD-100-P-5 恒温水浴箱（Grant，美国）；Densicheck Plus 麦氏浊度仪（Mérieux，法国）；Centrifuge 5810 R低温离心机（Eppendorf，德国）；HZQ-X300 C 恒温振荡器（Blue Pard，中国）。

2 方法

2.1 菌株的活化和菌液的制备

无菌条件下分别将金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923、MRSA 标准菌株ATCC43300 以及56株MRSA 临床菌株接种于MH 肉汤培养基中，于恒温空气浴振荡培养箱中以37 ℃、200 r/min振荡培养12 h。将上述菌液在MH琼脂培养基上划线培养，挑单克隆菌落于MH 肉汤培养基中，以37 ℃、200 r/min振荡培养，完成菌种的活化。活化后的菌液以8 000 r/min离心5 min，弃掉上清，无菌水重悬后，用麦氏浊度仪测定菌液浓度，再用灭菌的MH 肉汤培养基稀释菌液至1×106CFU/mL，作为实验菌液。

2.2 牛津杯法检测抑菌作用

参照文献[15]方法，于生物安全柜内将已灭菌的MH琼脂培养基倒入培养皿，待其凝固。此外，待MH 琼脂培养基冷却至45 ℃左右混入相应实验菌液100 μL，混合均匀后准确分取混菌培养基5.0 mL完全覆盖在已凝固的培养基上并保证其表面光滑，等待凝固。取已高压灭菌的牛津杯置于培养基表面，在杯中加入不同浓度的鸡矢藤醇提物，以灭菌双蒸水作阴性对照，左氧氟沙星工作液为阳性对照，将平板置于恒温培养箱中37 ℃下培养过夜，将平板取出后，采用“十字交叉法”测定抑菌圈直径，拍照后记录相关结果，以抑菌环直径>7 mm 判断为有抑菌作用。

2.3 最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的测定

参照文献[16]方法，无菌条件下采用倍比稀释法将鸡矢藤醇提物以及5 种抗生素（多黏菌数B、左氧氟沙星、庆大霉素、氨苄青霉素、万古霉素）进行稀释，从1∶2 倍比稀释至1∶64。倍比稀释后对应的鸡矢藤醇提物质量浓度分别为500、250、125、62.5和31.25 mg/mL。分别在96 孔板中先后加入100 μL 不同浓度的稀释药液以及抗生素，然后加入1×106CFU/mL MRSA 菌悬液100 μL，每个浓度设1 个复孔，同时作空白对照，于37 ℃恒温培养18 h，每孔加入0.5%TTC 继续培养2 h，观察受试菌的生长情况（观察有无变红色），以无菌生长（无红色）的最低稀释度为MIC，试验重复3次。测出MIC后，再依次从无细菌生长的各孔中吸取100 μL 培养物分别接种于营养琼脂平板，置于恒温培养箱37 ℃下培养18~24 h，平板上生长的菌落数<5 个对应的药液浓度为MBC。

2.4 鸡矢藤醇提物对MRSA生长曲线的影响

参考文献[17]方法，稍作修改。将MRSA 活化后用生理盐水配制成0.5 个麦氏浊度备用。实验分为阳性对照组（仅加菌液不加药液）、鸡矢藤醇提物（含1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC 及2×MIC）组。以不加菌液仅加相同浓度药液的为阴性对照组，用于消减药物颜色干扰。在含MH 液体培养液中分别加入1%菌液量和对应药液，37 ℃、180 r/min振荡培养24 h，每2 小时无菌取样1 次，用酶标仪测定600 nm 波长的吸光度（A）值，实验重复2 次。其中实验组A600为实验处理组与同浓度同时段阴性组的吸光度之差，取2次重复实验的平均值。以t为横坐标（X），A600为纵坐标（Y），绘制MRSA 生长曲线，分析不同浓度鸡矢藤醇提物对MRSA生长的影响。

2.5 微量棋盘法测定联合用药的抑菌效果

参照文献[18]方法，根据鸡矢藤醇提物和5种常用抗生素的MIC结果，采用倍比稀释法分别稀释使其终浓度分别1/32MIC～4MIC。采用微量棋盘稀释法测定鸡矢藤醇提物分别与抗生素（多黏菌数B、左氧氟沙星、庆大霉素、氨苄青霉素和万古霉素）联用的MIC，分析其部分抑菌浓度（fractional inhibitory concentration，FIC），实验全程在无菌条件下操作，并重复3 次。FIC 指数=联合用药时甲药MIC/单独应用甲药时MIC+联合应用乙药时MIC/单独应用乙药时MIC。判断标准：FIC 指数≤0.5 为协同作用，0.52为拮抗作用[2]。

2.7 统计学处理

采用GraphPad Prism 5 软件对实验数据进行分析并制作统计图，采用两独立样本非配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 牛津杯法检测抑菌试验结果

结果显示，鸡矢藤醇提物对ATCC25923、ATCC43300 及其中30 株MRSA 临床株均具有不同程度的抑菌活性（抑菌环直径>7 mm），对MRSA 临床株抑菌率占53.57%（30/56），见图1及表1。由图1可见，鸡矢藤醇提物浓度为500 mg/mL和250 mg/mL时均能表现出显著的抗菌活性，且MRSA 对不同浓度的鸡矢藤醇提物的敏感性呈一定的浓度依赖关系。结果表明鸡矢藤醇提物对MRSA 具有一定的抑菌作用。

表1 鸡矢藤醇提物的MRSA临床株抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of Paederia scandens ethanol extract on MRSA clinical strains

图1 牛津杯法抑菌试验结果图Figure 1 Antibacterial results determined with oxford cup method

3.2 鸡矢藤醇提物对MRSA的MIC

微量稀释法结果显示，鸡矢藤醇提物对金黄色葡萄球菌ATCC25923 和MRSA 标准菌ATCC43300的MIC 均为125.0 mg/mL，MBC 均为500.0 mg/mL，对MRSA 临床分离株的MIC 为62.5~250.0 mg/mL，MBC为250.0~500.0 mg/mL，见表2。

表2 鸡矢藤醇提物抗MRSA的MIC和MBC测定结果Table 2 MIC and MBC of Paederia scandens ethanol extract against MRSA

3.3 鸡矢藤醇提物对MRSA生长的影响

鸡矢藤醇提物对MRSA生长抑制曲线如图2所示，试验菌株为MRSA 临床株M3。与无药物处理对照组相比，1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC 和2×MIC 浓度鸡矢藤醇提物组的细菌均出现了不同程度的抑制生长趋势，细菌溶液的吸光度显著降低，且鸡矢藤醇提物浓度越高对细菌生长的影响越大。从生长曲线的变化来看，鸡矢藤醇提物缩短MRSA的对数生长期，延长生长停滞期，导致细菌数量明显减少。结果表明，鸡矢藤醇提物对MRSA 的正常生长和繁殖具有抑制作用，且抑制作用的强弱与鸡矢藤醇提物浓度呈正相关。

图2 鸡矢藤醇提物抗MRSA的动态抑菌曲线（n=3）Figure 2 Dynamic antibacterial curve of Paederia scandens ethanol extract against MRSA（n=3）

3.4 鸡矢藤醇提物与抗生素联合用药的抑菌作用

通过棋盘法测定鸡矢藤醇提物与不同抗生素之间的联合用药抑菌效果，结果如表3所示，鸡矢藤醇提物可显著提高庆大霉素（FIC=0.375）对ATCC43300 的抑菌作用，联合使用呈现出协同效果。此外，一定程度上提高左氧氟沙星（FIC=0.625）、氨苄青霉素（FIC=0.531）和万古霉素（FIC=0.531）对ATCC43300 的抑菌作用，联用呈相加作用，与多黏菌数B 联用对ATCC43300 呈无关作用。另外，鸡矢藤醇提物联用多黏菌数B（FIC=0.625）、氨苄青霉素（FIC=1.0）、左氧氟沙星（FIC=0.531）和庆大霉素（FIC=0.75）对MRSA 临床菌株M3 呈相加作用，而与万古霉素联用对MRSA 临床菌株呈无关作用，且联合左氧氟沙星（FIC=1.0）、庆大霉素（FIC=0.625）和万古霉素（FIC=0.516）对金黄色葡萄球菌ATCC25923均有相加的抑菌作用。

表3 鸡矢藤醇提物与抗生素联用对MRSA的FICTable 3 FIC of Paederia scandens ethanol extract in combination with antibiotics against MRSA

4 讨论

由于抗生素的滥用，MRSA 在临床的检出率越来越高，寻求解决耐药新方法迫在眉睫。目前新抗生素的研发陷入瓶颈，因此拓宽抗菌药物的来源渠道是一条重要举措。中药具有多功能、多靶点作用、不易产生耐药性、不良反应低以及与抗生素联用可逆转细菌耐药性等优点。因此，从中药寻求抗MRSA的新资源为临床治疗MRSA提供了新思路。

鸡矢藤含有丰富的环烯醚萜苷类成分，可健胃利胆，亦具有降糖、抗菌、消炎、抗癌等多种活性。已有研究[20]报道鸡矢藤对金黄色葡萄球菌具有抑制作用，MIC 为62.5 mg/mL。本实验进行了鸡矢藤醇提物的抗菌活性研究，牛津杯抑菌试验和微量稀释法结果显示鸡矢藤醇提物对金黄色葡萄球菌ATCC25923 具有抑菌作用，MIC 为125.0 mg/mL，优于文献报道的抑菌效果，原因可能与不同的提取工艺相关。同时，实验中鸡矢藤醇提物还对MRSA 临床分离株均表现出一定的抑菌和杀菌活性，MIC 为62.5~250.0 mg/mL，MBC 为250.0~500.0 mg/mL。此外，动态抑菌试验中加入不同浓度鸡矢藤醇提物后MRSA 菌体生长曲线发生明显变化，与正常的金黄色葡萄球菌生长曲线相比，加药组细菌经历比对照组稍长的延迟期，进入对数期生长后，细菌数量增加幅度缓慢，至稳定期时菌量比对照组明显减少。由于金黄色葡萄球菌在生长繁殖期，处于对数期生长时细菌的繁殖速度最快，代谢等方面表现最为旺盛，并且对外界各种环境因素的影响表现也最为敏感。本实验表明鸡矢藤醇提物能通过抑制MRSA对数生长期的增殖而发挥抗MRSA作用。

另外，本实验中微量棋盘法结果显示，鸡矢藤醇提物与庆大霉素联合用药可协同抗MRSA 标准菌株ATCC43300，显著降低庆大霉素的MIC，增加ATCC43300 对庆大霉素的敏感性，还能一定程度提高对金黄色葡萄球菌ATCC25923 和MRSA 临床株的抑菌作用，联用呈现出相加作用，但具体的协同、相加作用机制需进一步研究。庆大霉素是氨基糖苷类抗生素，可通过与细菌核糖体30 S亚基结合，阻断细菌蛋白质合成从而发挥抗菌作用，具有较强的耳、肾毒性[21]。鸡矢藤醇提物协同庆大霉素抑制ATCC43300，能够有效减少庆大霉素的用量，降低其毒副反应。且迄今为止，鸡矢藤醇提物提高氨基糖苷类抗生素对金葡菌的抗菌作用均未见报道。因此，鸡矢藤醇提物作为庆大霉素增效剂具有潜在的开发价值。此外，鸡矢藤醇提物联合多黏菌数B、氨苄青霉素、左氧氟沙星对MRSA 临床菌株，联合氨苄青霉素、左氧氟沙星和万古霉素对MRSA 标准株ATCC43300 以及联合左氧氟沙星和万古霉素对金黄色葡萄球ATCC25923均表现为相加作用，显示出一定的抑菌效果以及联合用药有效性，且结果中联合用药均未出现拮抗作用，说明鸡矢藤醇提物与以上抗生素配伍使用可行。以上结果均提示鸡矢藤醇提物的天然抗菌成分可能为解决抗生素耐药菌问题开辟新的领域。

中药是我国医学的宝贵遗产，不易产生耐药[22]，且有研究发现其能逆转抗生素耐药性恢复耐药菌对抗生素的敏感性[23-24]。本实验发现鸡矢藤醇提物具有抗MRSA作用，但研究所用药物为鸡矢藤醇提物，具体的有效成分及其抑菌机制有待进一步研究。