基于网络药理学-分子对接及实验研究探讨高良姜-香附药对治疗原发性痛经的作用机制

黄玉芳，谭银丰，3，任喜康，李永辉，3，4，张俊清，3，4，李海龙，3

（1.海南医学院药学院，海南 海口 571199；2.海南省热带药用植物研究开发重点实验室，海南 海口 571199；3.海口市黎族医药重点实验室，海南 海口 571199；4.热带转化医学教育部重点实验室，海南 海口 571199）

原发性痛经（primary dysmenorrhea，PD）属非器质性病变，被定义为女性行经前后或行经期间引发的腹部痉挛性疼痛，轻则头晕、恶心呕吐、冒冷汗、乏力等，重则出现昏厥、休克、甚至心理健康，危及生命[1]。随着社会生活压力、饮食结构、生活方式的转变，PD 患病率呈逐年增加的趋势[2-4]。全球范围内，患有PD 的育龄妇女达45%~93%，其中有3%~33%的患者属于严重疼痛。在一项以6所大学的550 名女生的原发性痛经评估调查中，PD 的患病率为80.9%，大多数疼痛程度为中度（56%）和重度（34.6%），严重影响女生的日常活动和学习能力[5-6]。临床医学认为，PD 的发生与内分泌及代谢因素相关，经期前列腺素、缩宫素、雌二醇、孕酮和NO 等水平的高低都是PD 发病的关键因素[7-8]，其治疗选择非甾体抗炎药为主，如布洛芬，但其会引起消化不良、头痛、嗜睡等副作用，如长期服用该类药物会增加心脏并发症的风险及肾脏问题、肝脏并发症[9-10]。中草药作为PD 的补充和替代疗法，具有多样化、低毒副作用和低成本等优势，有研究表明部分中草药对PD 的疗效确切，并且与非甾体类抗炎药相当或更胜[11-12]。

高良姜具有温胃止呕、散寒止痛之功；香附具有理气解郁、调经止痛的作用。二者成方首见于《良方集腋》，用于治疗胃炎、胃溃疡等寒性胃痛，《本草纲目》[13]中有记载高良姜-香附为伍的妙用，可行淤止痛、散寒疏肝、理气调经。截至目前，已有研究证实高良姜和香附能缓解PD 引起的疼痛[14-15]，但二者成方用于PD 治疗的机制尚未明确。因此本研究通过网络药理学-分子对接及实验对高良姜-香附药对治疗原发性痛经的作用机制进行阐明，为其进一步应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

高良姜和香附药材购自海南寿南山参业有限公司，经海南医学院生药学教研室田建平教授鉴定为姜科山姜属植物高良姜Alpinia officinarumHance的干燥根茎，香附为莎草科植物莎草Cyperus rotundus L.的干燥根茎；月月舒痛经宝颗粒（仲景宛西制药股份有限公司，规格：10 g/袋，批号Z41021972）；苯甲酸雌二醇（上海源叶生物科技有限公司，批号Y12O6D4246）；缩宫素注射液（上海禾丰制药有限公司，规格：1 mL∶10 U，批号H31020850）；前列腺素E2（PGE2）ELISA 试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号E20220208-20561A）；前列腺素F2α（PGF2α）ELISA 试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号E20220208-20562A）；β-内啡肽ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20230508）；一步法PAGE凝胶快速制备试剂盒（上海雅酶生物医药科技有限公司，批号036C2300）；RIPA 裂解液（强）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、SDSPAGE 蛋白上样缓冲液（5X）、蛋白酶抑制剂混合物（通用型，100X）、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）、特超敏ECL 化学发光试剂盒、Western 一抗、二抗稀释液（碧云天生物技术有限公司，批号P0013B、P0012S、P0015、P1005、A0208、A0216、P0018AS、P0023A、P0023D）；PVDF 膜[赛文创新（北京）生物科技有限公司，批号20230301]；GAPDH（abclonal，批号AC002）；p38、COX-2（武汉三鹰生物技术有限公司，批号27308-1-AP、66234-1-Ig）；PI3K、磷酸化PI3K、AKT、磷酸化AKT（Cell Signaling Technology公司，批号4257、17366、4691、4060）；β-Actin（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号GB11001）；Eastep®Super总RNA 提取试剂盒（上海普洛麦格生物产品有限公司，批号0000495807）；PCR 引物（天一辉远基因科技有限公司）。

SynergyHTX 多功能酶标仪（美国Bio-Rad 公司）；ChemiDos XRS 高灵敏度化学发光成像系统（美国Bio-Rad 公司）；CFX96 Touch 梯度荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 实验动物

SPF 级ICR 雌性小鼠60 只，体质量18~22 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（湘）2019-0013。实验前进行适应性喂养3 d，自由饮水饮食，室温20~27 ℃，湿度40%~60%，12 h昼夜更替。动物实验经海南医学院伦理委员会批准（编号：HYLL-2023-393）。

1.3 获取高“高良姜-香附”药对活性成分及活性成分靶点

以高良姜、香附作为Herb name 在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP, http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）检索药物的所有成分。对活性成分进行筛选，其筛选条件为口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%，类药性（drug likeness,DL）≥0.18[16]，并结合数据库文献检索香附有关成分的研究，纳入不符合该条件的成分。所得活性成分在TCMSP 中获得的targetname，进行去重后，通过Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/）进行转化得Genename。将筛选得到的活性成分通过TCSMP 和PubChem（http：//pubchem.ncbi.nlm.gov）获取分子式，再通过Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch）预测靶点，选择可能性评分为≥0.06 的靶点，结合TCSMP 中relatedtargets，合并去重后即得。

1.4 获取疾病相关靶点

疾病靶点以“dysmenorrhea”和“primarydysmenorrhea”为检索词分别在GeneCards、DrugBank、OMIM、TTD和DisGenet检索，将成分靶点和疾病靶点通过微生信制图平台作Venn图得到交集靶点。

1.5 蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络的构建

将成分-疾病的交集靶点导入STRING 数据库，物种限定为“homosapiens”，最低交互作用设置为>0.9，隐藏游离节点，将相互作用关系的TSV 格式数据导入Cytoscape3.7.2 软件中绘制PPI 网络图，并使用插件CytoNCA 进行拓扑分析，以度中心性（度DC）、中介中心性（间距中心度BC）和接近中心性（紧密中心度CC）的中位数筛选核心靶点。

1.6 KEGG与GO通路富集分析

将药物成分-疾病交集靶点录入Metascape 平台，选择P<0.05，进行KEGG 通路和GO 富集分析，GO 分析包括生物过程、分子功能及细胞组分。筛选出与PD 相关的前21 条通路和前10 的生物学功能进行可视化处理。微生信制图平台作图。

1.7 构建“成分-靶点-通路”网络

将活性成分、交集靶点、相关通路导入Cytoscape 3.7.2，三者均用节点表示，三者之间的相互关系用边表示，运用插件CytoNCA 进行拓扑分析，以Degree 值筛选关键的活性成分及核心靶点用于后续分子对接。

1.8 分子对接

通过PDB 数据库下载网络图中核心靶点与PPI网络中核心蛋白的3D 结构，活性成分的Mol2 格式从TCSMP数据库直接下载。根据DrugBank和文献研究，布洛芬作为治疗PD 的一线药物，将其作为阳性对比，从Pubchem 下载其3D 结构的SDF 格式，再经过OpenBabel 转换成Mol2 格式，蛋白中的水分子和配体经Pymol 处理，运用Autodock 对受体蛋白和配体成分进行加氢处理，转化为pdbqt 格式，再进行分子对接模拟计算，最后经Pymol进行可视化处理。对接结果以结合能大小判断，数值<0 kcal/mol，说明配体和受体能自发的结合，当数值<-5 kcal/mol，说明其结合情况较好[17-18]，分子对接结合能可视化由Chiplot平台绘制热图。

1.9 良附醇提物的制备

称取高良姜、香附各100 g，浸泡30 min，70%（φ）乙醇，料液比1∶8（g∶mL），提取2 次，1 次2 h，将所得提取液浓缩干燥得浸膏7.17 g 生药/g，取适量用水配成所需浓度备用。

1.10 动物分组及模型制备

60 只雌性小鼠，随机分成6 组，每组10 只，分别为正常、模型、阳性药痛经宝颗粒组（5 g/kg）、良附醇提物组（0.9、0.3、0.1 g/kg）。在课题组前期考察高良姜提取物治疗痛经的实验和文献基础上[19-20]，以苯甲酸雌二醇和缩宫素联合制备小鼠PD 模型：每天于小鼠腹部皮下注射苯甲酸雌二醇10 mg/kg，连续注射7 d。正常组注射等体积生理盐水。从造模第1 天起，除正常、模型组外，按分组给各组小鼠灌胃给予相应剂量药物。小鼠于第7 天末次给药并皮下注射苯甲酸雌二醇后30 min，腹腔注射缩宫素20 u/kg。

1.11 观察扭体反应

注射缩宫素后观察，记录30 min 内扭体次数及开始时间（潜伏期），以小鼠腹部凹陷、后肢外伸、躯体伸展和扭曲为扭体标准，并计算扭体抑制率。

抑制率=（模型组扭体次数均值-给药组扭体次数均值）/模型组扭体次数均值×100%。

1.12 组织学检查

取小鼠子宫同侧同位段子宫组织于4%（φ）多聚甲醛溶液中固定，经常规石蜡包埋切片，经环保型脱蜡液和梯度酒精脱蜡水化，用苏木素和伊红染色，再将切片依次放入无水乙醇和二甲苯浸泡透明，最后封片，于显微镜下观察子宫组织病理形态。

1.13 ELISA 法测定血清中β-EP、PGE2和PGF2α的水平

各组小鼠进行摘眼球取血，将取完后静置2 h的全血进行离心获得血清，于-80 ℃保存，之后严格按照试剂盒说明书操作，检测各组小鼠血清中β-EP、PGE2和PGF2α的水平。

1.14 Western blot 法检测子宫组织中COX-2、p38、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT的蛋白水平

用预冷的生理盐水清洗子宫组织残留的血液，称取50 mg组织于2 mL研磨管中，按1∶10质量体积比加入含蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液，置于高速低温组织研磨仪自动匀浆，再于4 ℃放置1 h 后，12 000 r/min 离心15 min，用BCA 蛋白试剂盒对上清进行蛋白定量并配平，分装于-80 ℃保存，使用前100 ℃煮6 min。按照一步法PAGE 凝胶快速制备试剂盒说明制备电泳胶，加入40 μg 蛋白，电泳结束转膜至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h，TBST 洗涤3 次，5 min/次，一抗4 ℃孵育过夜，洗涤3 次，10 min/次，二抗室温孵育1 h，洗涤4次，5 min/次，显影，ImageJ软件进行定量分析。

1.15 RT-qPCR 检测COX-2、MAPK14、PI3K 和AKT的mRNA表达

用预冷的生理盐水清洗子宫组织残留的血液，冰上称取30 mg 子宫组织于2 mL 研磨管中，按Eastep®Super 总RNA 提取试剂盒说明书进行操作，提取RNA，进行核酸定量及A260/280 检测后，分装于-80 ℃保存。根据反转录试剂盒说明书反转录为cDNA。用Hieff®qPCRSYBR Green Master Mix（No Rox）制备20 μL 反应体系，于CFX96 Touch 仪器上进行PCR 反应，反应条件参照说明书，采用2-ΔΔCt法分析RT-qPCR结果。引物序列见表1。

表1 qPCR所用引物序列Table 1 Sequences of primers used in qPCR

1.16 统计分析

采用Graphpad Prism 8.0 软件进行数据统计分析，数据以表示，采用组间单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 良附活性成分的筛选结果

通过TCSMP 数据库和文献查阅，去掉无靶点的成分，共获得29 种活性成分，其中香附15 个、高良姜9 个、共有成分5 个，见表2。将成分含量和活性高，但不符合TCSMP 筛选条件的成分纳入，分别是诺卡酮（Nootkatone）、DPHA（（5R）-5-hydroxy-7-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）-1-phenylheptan-3-one）、香附烯酮（cyperotundone）和α-香附酮（（4aR，7R）-7-isopropenyl-1，4a-dimethyl-3，4，5，6，7，8-hexahydronaphthalen-2-one）。

2.2 活性成分-疾病靶点筛选结果

良附活性成分靶点合并去重后共有719个。通过GeneCards、DrugBank、OMIM、TTD 和DisGenet数据库检索获取疾病靶点，经合并去重，获得PD 的相关靶点662 个，将成分靶点与疾病靶点通过作韦恩图得到交集靶点117个，见图1。

图1 高良姜-香附与原发性痛经交集靶点韦恩图Figure 1 Venn diagram of the intersection targets between Alpinia officinarum-Cyperus rotundus and primary dysmenorrhea

2.3 PPI网络分析结果

将成分-疾病交集靶点导入STRING 数据库，获取PPI 信息，隐藏游离节点，如图2。将结果导入Cytoscape 3.7.2 软件进行可视化，删去游离连接的6个节点，删除重复边，得到80 个节点、442 条边。运用插件CytoNCA进行拓扑分析，度中心性（度DC）、中介中心性（间距中心度BC）和接近中心性（紧密中心度CC）得到中位数分别为10、47.415、0.323，经中位数筛选最终得到10 个核心靶点，节点越大，颜色越趋向红色，说明度值越高，见图2。通过筛选最小相互作用大于0.9 的网络，对网络图中排名前25的核心靶点，通过Chiplot作柱状图，见图3。Degree值大于30 的前5 个基因分别为信号转导和转录激活因子（STAT3，度=42）、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸肌醇-3-激酶（PIK3CA，度=36）、丝氨酸／苏氨酸激酶（AKT1 度=34）、雌激素受体（ESR1，度=32）、细胞肿瘤抗原p53（TP53，度=32），提示“高良姜-香附”药对可能通过这5个核心基因治疗PD。

图3 PPI图中的靶点排序（排名前25位）Figure 3 Ranking of targets in PPI network（top 25）

2.4 KEGG和GO富集分析结果

将成分-疾病交集靶点导入Metascape平台进行KEGG 通路分析和GO 富集分析，选择Hsapiens 进行分析。GO 富集分析生物过程共有138 条，前10条生物过程涉及激素反应、对异种刺激的反应、细胞对有机环状化合物的反应、血液循环、对氧气水平降低的反应、烯烃化合物代谢过程、细胞群增值的负调控、细胞迁移的正向调节、对雌二醇的反应和腺体发育等，如图4。细胞组成共105 条，涉及膜筏、树突、神经元细胞体、分泌颗粒腔、轴突和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物等。分子功能共149条，涉及单加氧酶活性、蛋白质同二聚化活性、核受体活性、肽结合、激酶结合和突触后神经递质受体活性等，前10条作图，见图4。KEGG 富集分析获得与117个交集靶点具有显著性相关的通路共157条，根据文献检索筛选出与PD相关的前21条关键通路，涉及PI3K/AKT 信号通路、钙信号通路、MAPK 信号通路、细胞衰老、神经活性配体-受体相互作用等，见图5。结果表明，良附可通过激素调节、炎症相关通路、中枢阵痛、平滑肌解痉、免疫调节的方式治疗PD。

图5 KEGG 富集分析Figure 5 KEGG enrichment analysis

2.5 “成分-靶点-通路”网络构建

将筛选得到的29 个活性成分、117 个交集靶点以及KEGG 富集与PD 相关的21 条通路，导入Cytoscape3.7.2软件进行可视化，删去重复边159条，得到167 个节点，849 条边，见图6。通过CytoNCA分析良附最关键的前5 种活性成分为：槲皮素（quercetin 度=61）、山柰酚（kaempferol，度=44）、美紫檀素（medicarpin，度=31）、高良姜素（galangin，度=29）、木犀草素（luteolin，度=37），分析靶点节点度值大于20 的有：前列腺素G/H 合酶2（PTGS2，度=26）、雌激素合酶（CYP19A1，度=22）、丝氨酸／苏氨酸激酶（AKT1，度=20）、前列腺素G/H 合酶1（PTGS1，度=20）。

图6 “成分-靶点-通路”网络Figure 6 Network of “components-targets-pathway”

2.6 分子对接

根据CytoNCA 分析结果，见表3，“成分-靶点-通路”网络图中选择Degree 排列前5 的活性成分和阳性药物与度值为26的核心靶点及PPI网络分析的前5 个核心基因使用AutoDock 软件进行分子对接，对接结果见图7，阳性药物布洛芬除与STAT3 的对接为-4.50 kcal/mol外，其活性成分与靶蛋白的最低结合能均小于-5 kcal/mol，说明配体与受体的结合情况较好，并且中药活性成分的对接结果较阳性药物的好。将6个靶蛋白与分子最低结合能进行可视化处理，如图8，medicarpin 和PIK3CA 分别在ASP-933、TYR-836处形成氢键，与TP53分别在HIS-178、ASN-239 处形成氢键，与PTGS2 在ASN-382 处形成氢键，与STAT3 分别在ASP-371、LYS-370、GLU 处形成氢键，与ESR1 在GLU-353、ARG-394 处形成氢键，kaempferol 和AKT1 分别在ARG-76、GLN-61、LEU-78、GLN-59、SER-56 处形成氢键。由活性成分与阳性药物的分子对接结果，验证了网络药理学具有一定的可靠性。

图7 “高良姜-香附”药对活性成分与关键靶标的分子对接结果Figure 7 Molecular docking results of active components of Alpinia officinarum-Cyperus rotundus to key targets

图8 分子对接结果可视化Figure 8 Visualization of molecular docking results

表3 PPI网络与“成分-靶点-通路”网络的CytoNCA分析结果Table 3 CytoNCA analysis results of PPI network and"component-target-pathway"network

2.7 扭体反应

与正常组比较，模型组的潜伏期时间明显缩短，扭体次数增加，与模型组相比，各组扭体次数均有显著性减少，潜伏期时间有所增加，见表4。

表4 小鼠扭体实验结果Table 4 Results of writhing experiment in mice

2.8 小鼠子宫病理变化

正常组小鼠子宫内膜细胞平整、无水肿、充血和炎性浸润等异常形态。与正常组比较，模型组上皮细胞坏死，有明显的水肿，多处充血和炎性浸润，成功制备痛经模型。与模型组比较，给药组的水肿充血及炎性浸润程度有所减轻，并且良附醇提物高剂量组效果更好，见图9。

图9 各组小鼠子宫组织形态（HE，100×）Figure 9 Morphology of mouse uterine tissue in each group（HE，100×）

2.9 小鼠血清中β-EP、PGE2和PGF2α含量

与正常组比较，模型的PGE2和β-EP 水平显著性降低，PGF2α水平显著性升高，与模型组比较，阳性组和不同给药组的PGE2和β-EP 水平均显著性升高，阳性组和不同给药组的PGF2α水平显著性降低，见表5。

表5 小鼠血清中PGE2、β-EP和PGF2α的含量Table 5 Levels of serum PGE2，β-EP and PGF2α in mice(，n=7) ρ/(pg·mL-1)

表5 小鼠血清中PGE2、β-EP和PGF2α的含量Table 5 Levels of serum PGE2，β-EP and PGF2α in mice(，n=7) ρ/(pg·mL-1)

与正常组比较：#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。

?

2.10 Western blot 法检测子宫组织中COX-2、p38、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT的蛋白水平

与正常组比较，模型组小鼠子宫组织中COX-2、p38、PI3K、和p-AKT 的蛋白表达显著升高；与模型组比较，阳性组和良附醇提物低、中、高剂量组COX-2、p38、PI3K、p-PI3K 和p-AKT 的蛋白表达显著降低，AKT 蛋白表达无显著变化，差异无统计学意义。见表6和图10。

图10 各组小鼠子宫组织相关蛋白表达Figure 10 Expression of uterine tissue related proteins in each group of mice

表6 各组小鼠子宫组织相关蛋白表达Table 6 Expression of uterine tissue related proteins in each group of mice(，n=3)

表6 各组小鼠子宫组织相关蛋白表达Table 6 Expression of uterine tissue related proteins in each group of mice(，n=3)

与正常组比较：#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。

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2.11 RT-qPCR 检测COX-2、MAPK14、PI3K 和AKT的mRNA表达

与正常组比较，模型组小鼠子宫组织COX-2、MAPK14 和PI3K 的mRNA 水平显著升高。与模型组比较，阳性组和良附醇提物低、中、高剂量组COX-2、MAPK14 和PI3K 的mRNA 水平显著降低，AKT 的mRNA 无显著变化，差异无统计学意义，见表7。

表7 各组小鼠子宫组织mRNA表达Table 7 mRNA expression in uterine tissue of mice in each group(，n=3)

表7 各组小鼠子宫组织mRNA表达Table 7 mRNA expression in uterine tissue of mice in each group(，n=3)

与正常组比较：##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。

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3 讨论

通过网络药理学和动物实验探讨良附治疗PD的作用机制，构建“成分-靶点-通路”网络，体现“高良姜-香附”药对中多活性成分作用于多靶点、通路或作用于同一靶点发挥疗效，为治疗PD 的药效研究和作用机制提供依据。研究结果表明，良附中槲皮素、山柰酚、美迪紫檀素、木犀草素、高良姜素、DPHA 及α-香附酮等29 个成分可作为治疗PD 的潜在活性成分。槲皮素和山柰酚被证实具有抗炎和抗氧化等作用[21-22]。在分子对接结果中，美迪紫檀素显示更佳的结合能力，该成分可经多种药用植物分离获得，并被证实具有抗炎、抑菌和保护神经系统等药理活性[23]。木犀草素通过调节炎症介质和炎症相关的信号通路抑制炎症反应，如调节前列腺素、白介素、干扰素，调控NF-κB、MAPK、PI3K、AKT信号通路，可上调信号传导、转录活化因子6（p-STAT6）和抑制转录激活因子3（p-STAT3），将促炎化为抗炎，其发生部位主要在免疫细胞内部[24-25]。香附中的挥发油、香附烯和香附酮都能使雌性小鼠上皮细胞角质化，具有雌激素样活性，可与雌激素竞争相应受体，从而避免PGF2α的增加，减少子宫异常收缩[26]。温东婷等[27]发现α-香附酮可抑制大鼠离体子宫自发性收缩，并且对缩宫素引起的收缩具有明显的抑制作用，首次证明α-香附酮是香附中治疗PD 的主要活性成分之一，根据文献研究[28]，诺卡酮能够介导炎症通路，具有抗炎、抗氧化和抗血小板的药理活性。相关文献表明，高良姜素具备良好的抗炎活性，其作用机制主要通过抑制炎症因子、PI3K、AKT 及MAPK 等信号通路，这与本研究结果一致，目前高良姜素在神经炎症、肾炎、肠炎及风湿性关节炎等模型都具有显著的抗炎活性[29]。而炎症反应是引起PD 的主要机制之一，因此认为高良姜素可能通过该机制达到治疗作用。高良姜中的主要活性成分除了黄酮类成分，其二芳基庚烷类成分也具有很好的抗炎、抗氧化、抗病毒等活性，高良姜中最关键的二芳基庚烷类成分是DPHA，具有显著的抗炎和抗雌激素作用[30-31]。

117 个交集基因通过构建PPI 网络与“成分-靶点-通路”网络结果表明，度值靠前由大到小依次为STAT3、PIK3CA、AKT1、ESR1、TP53、PTGS2、TNF、CAV1、FOS、MYC、VEGFA。根据分子对接结果，PTGS2 与活性成分的结合能力更强，其为花生四烯酸代谢途径转化成前列腺素类物质的关键合酶，现已有研究表明，PGF2α和PGE2含量的比值被认为是引起痛经的重要发病机制之一，并且PGF2α在痛经中的作用更重要[32]，子宫合成与分泌的PGE2能够起到松弛平滑肌的作用，而PGF2α会引起子宫平滑肌收缩。在PD 中，子宫收缩力的异常增加类似于前列腺素或其衍生物诱导的子宫收缩力，痛经的强度与PGF2α的释放量成正比。60%以上的患者出现的恶心、呕吐和腹泻等症状与前列腺素的不良作用相似[33]。β-EP 是一种具有内源性镇痛作用的神经内分泌激素，其含量高低与痛经程度呈负相关，是影响痛经的关键指标之一[34-35]。KEGG 结果表明，高良姜-香附治疗PD 关键的机制依次是炎症通路、中枢镇痛及激素调节，相关通路均有显著性差异，以PI3K/AKT 信号通路显著性最大，PI3K 和AKT 介导细胞的增殖、分化和凋亡等作用，调控炎症因子的释放[36]，调控该通路信号转导能够抑制炎性因子水平，并调节COX-2、VEGF和BCL-2等下游因子的含量[37]。有研究表明[38]，MAPK 通路与神经病理性疼痛的发生相关，该通路激活会引炎症因子的高表达，加重痛经。综上，本研究通过动物实验验证上述结果。动物实验结果表明，模型组小鼠的扭体潜伏期缩短，扭体次数增加，其子宫组织形态有明显的水肿，上皮细胞坏死、充血及大量的炎性浸润，小鼠血清中PGE2和β-EP 含量降低，PGF2α含量增加，Western blot和RT-qPCR 结果表明，模型组小鼠子宫组织中COX-2、p38、PI3K、和p-AKT 的蛋白表达显著升高，良附醇提物组均有所降低，并且mRNA 的表达与蛋白表达趋势一致，验证了良附可能通过调节PI3K/AKT、MAPK、PTGS2 的相关蛋白和mRNA的表达缓解痛经，这与网络药理学分析结果一致。

本研究通过网络药理学方法及实验验证，对良附的关键活性成分及药理作用机制进行阐明，体现了多成分与多靶点之间的相互作用关系。动物实验和分子对接在一定程度上虽能证明网络药理学具有一定可靠性和准确性，具有一定的参考价值，但存在以下不足：验证的蛋白较为常见，并且检索方法和数据库与其他网络药理学方法较为重复。因此，该研究的结论仍需要进一步验证。