基于网络药理学和动物实验探究穿心莲内酯对5-Fu所致大鼠化疗性肠黏膜炎的预防作用

邱雨馨，邝杰辉，朱俊锦，林曼静，邵艳华

（1.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006；2.广州市花都区天贵社区卫生服务中心，广东 广州 510800）

目前，化疗仍是治疗实体肿瘤的首选手段，随着肿瘤发病率不断升高，化疗的效果和副作用备受关注。化疗性肠黏膜炎（chemotherapeutic intestinal mucositis，CIM）是化疗过程中频发的副作用之一，是在肿瘤化疗过程中导致的肠道炎性病变或者溃疡性病变，表现为恶心、呕吐、食欲减退、体重减轻和腹泻等临床症状[1]，不仅限制抗肿瘤药物的应用，而且影响化疗进程。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）是化疗最常用的药物，5-Fu 化疗引起的肠道黏膜炎发病率高达50%~80%[2]，其引起的肠黏膜炎可通过IL-6/STAT3 信号通道调控介导上皮间充质转化干预组织细胞的修复，其中IL-6 促炎症细胞因子在IL-6/STAT3 信号通道中起着重要作用[3]，促炎细胞因子TNF-α能够通过一些信号通路而诱导IL-6和IL-1 等因子的表达增加从而导致炎症反应[4]。穿心莲内酯是来源于中药穿心莲的二萜内酯类化合物，具有良好的抗炎作用[5]，以穿心莲内酯制成的穿琥宁注射剂在临床上广泛用于治疗腹泻，有助于减轻炎症反应[6]。穿心莲内酯可减轻小鼠结肠炎或腹泻引起的肠道损伤[7]，显著缓解肿瘤小鼠结肠炎而不会降低其肿瘤抑制作用[8]，可调节p38 MAPK 通路进而抑制5-Fu导致的肠道细胞凋亡[9]。

网络药理学强调从系统层次和生物网络的整体角度出发，解析药物及治疗对象之间的分子关联规律，被广泛应用于药物和中药活性化合物发现、整体作用机制阐释等方面，为中药复杂体系研究提供了新思路，为临床合理用药、新药研发等提供了新的科技支撑。本研究拟运用网络药理学及分子对接技术探讨穿心莲内酯治疗化疗性肠黏膜炎的可能作用机制，同时通过构建5-Fu 诱导大鼠肠黏膜炎模型，研究穿心莲内酯预防给药对化疗性肠黏膜炎模型鼠体质量、脏器指数、肠组织病变以及血清炎症因子水平的影响，明确穿心莲内酯对化疗性肠炎的预防作用，为穿心莲内酯预防化疗性肠黏膜炎的作用机制及临床应用提供依据。

1 网络药理学材料与方法

1.1 穿心莲内酯潜在作用靶点的获取

通过Pubchem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得穿心莲内酯的结构信息，并从Swiss Target Prediction（http：//www. swisstarget prediction.ch/）、SuperPred（http：//prediction. charite.de/）、SEA（https：//sea.bkslab.org/）、STITCH（https：//ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database/id/208）、Pharmmapper（http：//lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html）、HERB（http：//herb.ac.cn/）、HIT-2（http：//www.badd-cao.net：2345/）数据库检索获得穿心莲内酯潜在作用靶点。在UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org/）将所得靶点名称进行标准化。

1.2 穿心莲内酯治疗CIM潜在作用靶点的获取

通过检索Genecards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//www. omim.org/）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）、TTD（http：//www.db.idrblab.net/ttd/）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org/）和DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）6 个数据库收集与CIM 相关的基因，在UniProt 数据库将所得靶点名称进行标准化。通过R语言编程软件加载Venn程序包，将得到的CIM基因与穿心莲内酯的靶基因取交集，绘制Venn 图，得到穿心莲内酯治疗CIM的潜在靶点。

1.3 靶点蛋白相互作用网络（PPI）的构建和核心基因的获取

使用STRING 数据库（https：//www.string-db.org/）和Cytoscape 3.9.1 软件构建PPI 网络。将“1.2”项下获取的潜在靶点输入到STRING 数据库中限定物种为人类，置信度为高置信度0.9，获得PPI 网络。使用Cytoscape 3.9.1 软件中的CytoNCA 插件，过滤条件设置中间中心性（betweenness centrality,BC）、度中心性（degree centrality, DC）、接近中心性（closeness centrality, CC）、特征向量中心性（eigenvector centrality, EC）、局部连通性（local average connectivity-based method,LAC）、网络中心性（network centrality,NC）都大于中位值，筛选得到核心靶点，再将得到的核心靶点文件导入Cytoscape 3.9.1软件，绘制核心靶点的PPI网络图。

1.4 关键靶点的基因本体（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

将穿心莲内酯治疗CIM 的潜在靶点通过R 语言编程软件加载colorspace、stringi、ggplot2、org.Hs.eg.db 等程序包，设置P<0.05，进行GO 富集分析和KEGG通路分析。

1.5 分子对接

从RCSbPDB（http：// www.rcsb.org/）数据库获得核心靶点的三维结构，并用PyMOL 软件去除蛋白质中的配体小分子和水分子。用Chem3D软件把穿心莲内酯转换为三维结构，并优化空间构象为最小值。通过AutoDock Tools 软件将受体加氢，设置活性口袋，调整参数，使活性口袋包含受体。使用Vina 软件进行对接，结合能≤-5 kcal/mol 表明结合活性较好。最后使用Discovery Studio 软件对结果进行可视化处理。

2 动物实验

2.1 仪器与试药

BX60 荧光显微镜（日本OLYMPUS 公司）；FA2104 电子天平（上海市安亭电子仪器厂）；KQ-500DE 型数控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；5-Fu（天津金耀药业有限公司，批号2109081）；穿心莲内酯（成都埃法生物科技有限公司，批号AF20121551）；金双歧三联活菌片（内蒙古双奇药业有限公司，批号202109291）；大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA Kit［艾尔吉（广州）生物科技有限公司，批号20220909］；大鼠白细胞介素（IL-6）ELISA Kit［艾尔吉（广州）生物科技有限公司，批号20220909］；0.9% 生理盐水（海博生物，批号HBPP008）。

2.2 实验动物

SPF 级SD 大鼠，雄性，体质量190~210 g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，生产许可证号SCXK（辽）2020-0001。饲养环境：温度（24±2）℃，湿度（60±5）%，12 h 明暗周期轮替，标准饲料喂食，自由进食和饮水。动物均饲养于广东药科大学实验动物中心，所有程序依据《实验动物管理条例》实施，由广东药科大学实验动物伦理委员会批准（批准号：gdpulac2020263）。

3 实验方法

3.1 动物造模和给药

将35 只健康雄性SD 大鼠随机分成5 组，分别为空白组（Control）、模型组（MG）、阳性对照组（CG）、穿心莲内酯低剂量组（APL）、穿心莲内酯高剂量组（APH）5 个组别，每组7 只。从第1 天起，早上9：00分别给各组大鼠灌胃相应的药物，阳性对照组大鼠灌胃给予700 mg/kg 的金双歧三联活菌片溶液，穿心莲内酯低剂量组大鼠给予30 mg/kg 的穿心莲内酯，高剂量组大鼠给予100 mg/kg 的穿心莲内酯，空白组和模型对照组灌胃给予相应体积的0.9%生理盐水，在造模前给药5 d，造模期间继续给药，连续给药10 d。第6 天起，给药1 h 后，除空白组外，分别给各组大鼠腹腔注射35 mg/kg 5-Fu 造模，空白组大鼠腹腔注射相应体积的0.9%生理盐水，连续5 d。

3.2 一般状态和体质量观察

每天观察各组大鼠的毛发光泽度、清洁度、颜色、活动情况、精神状态及死亡等一般状态；记录大鼠体质量，实验结束后计算造模期间大鼠体质量下降率。

体质量下降率=（原体质量-下降后的体质量）/原体质量×100%

3.3 腹泻情况观察

首次造模24 h 后，观察大鼠腹泻情况，以后每天定时观察至实验结束，最后一天药物灌胃1 h 后观察，腹泻情况以腹泻评分表示，评分越高表明腹泻越严重。评分标准参考文献[11]报道方法，对大便的状态进行0~3分4级打分（表1）。

表1 大鼠的腹泻评分标准Table 1 Scoring criteria of diarrhea in rats

3.4 脏器指数

末次给药后，对各组大鼠进行禁食不禁水12 h，眼眶采血，脱颈处死后剖开腹腔，取出肝脏、脾脏，用滤纸吸干液体，称定质量，计算肝脏和脾脏指数：

肝脏（脾脏）指数=100×肝脏（脾脏）质量/体质量。

3.5 肠道组织HE染色和病理形态学观察

取距回肠末端2~3 cm 肠段，经生理盐水清洗后用滤纸去除水分后，放入4%多聚甲醛固定液中，经脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、组织水化、HE 染色等步骤后进行图像采集及分析，对正常组织或有明显病变的组织均采用数码成像系统拍照记录。

3.6 炎症因子水平检测

眼眶取血3 mL左右，以3 000 r/min离心10 min，收集血清，在-4 ℃下保存。采用ELISA法检测大鼠血清中IL-6、TNF-α水平。

3.7 统计学方法

实验数据采用SPSS22.0 软件分析，GraphPad Prism 9 软件统计作图，实验数据用表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），P<0.05 为差异有统计学意义。

4 结果

4.1 穿心莲内酯靶点筛选及其治疗CIM的交集靶点

通过Unipot 数据库进行标准化处理，取并集、去重后，得到521 个穿心莲内酯潜在作用靶点。利用Genecards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank和DisGeNET疾病数据库分别收集CIM相关的疾病靶点，经合并去重后获得相关的疾病靶点3 104 个。与穿心莲内酯对应的靶点基因取交集，获得190 个共同基因靶点，为穿心莲内酯治疗CIM 的关键靶点。利用R语言编程软件绘制Venn图，见图1。

4.2 穿心莲内酯治疗CIM的核心靶点分析

将190 个共同靶点导入String 数据库中，构建PPI 网络模型，去除孤立的节点，导出PPI 网络分析数据（图2）。利用Cytoscape 3.9.1 软件分析PPI 网络分析数据，根据靶点的degree 值正相关设置节点颜色（degree 值由小到大对应节点颜色由浅粉色到深红色）。degree 值大即表示该靶点处于网络的核心地位。通过加载插件CytoNCA，计算每个节点的打分，然后利用R语言编程软件对打分进行筛选，根据DC≥5.0、EC≥0.024、LAC≥1.6、BC≥23.76、CC≥0.051和NC≥2.067（中位数）等拓扑学参数条件初步筛选出48个节点，最后将得到打分高于中位数的节点重新导入Cytoscape 再筛选1 次，得到PPI 网络核心，筛选出20 个穿心莲内酯治疗CIM 的核心靶点（图2）。以图表形式显示20个核心靶点的拓扑学分析参数，见表2，包括有STAT3、TNF和IL6等与炎症相关的靶点，这表明穿心莲内酯可能通过作用于这些靶点治疗CIM。

图2 穿心莲内酯治疗CIM的核心靶点分析Figure 2 Analysis of core target of andrographolide in the treatment of CIM

表2 核心靶点的拓扑学参数分析Table 2 Topological parameter analysis of core target

4.3 GO功能富集分析与KEGG通路分析

GO 富集分析得到生物学过程（BP）相关条目2 315 条、分子功能（MF）相关条目184 条及细胞组分（CC）相关条目101 条（P<0.05）。从结果可看出（图3），穿心莲内酯治疗CIM 的BP主要富集在对氧化应激反应（response to oxidative stress）、MAPK 级联的正调控（positive regulation of MAPK cascade）和细胞对化学应激的反应（cellular response to chemical stress）等方面，MF 主要富集在膜筏（membrane raft）、膜微区（membrane microdomain）和转移酶复合物、转移含磷基团（transferase complex，transferring phosphorus-containing groups）等方面，CC 主要富集在蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性（protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）和蛋白丝氨酸激酶活性（protein serine kinase activity）等方面。通过KEGG 信号通路分析，共富集得到177 条相关信号通路（P<0.05）。其中相关度较高的前30条通路，主要包括HIF-1、TNF、Toll 样受体和T 细胞受体等与炎症密切相关的信号通路，提示穿心莲内酯可能通过作用以上多条通路来发挥治疗CIM的作用。

图3 穿心莲内酯治疗CIM的基因富集分析Figure 3 Gene enrichment analysis of andrographolide in the treatment of CIM

4.4 穿心莲内酯–核心靶点分子对接

选取和炎症相关的核心靶点IL-6、TNF 和STAT3，与穿心莲内酯进行分子对接获得三维图（图4），穿心莲内酯与IL-6、TNF 和STAT3 对接的结合能均小于-5 kcal/mol（表3），说明穿心莲内酯与靶点之间具有良好对接活性，氢键是相互作用的主要形式。其中，穿心莲内酯与IL-6 的氨基酸残基THR139、ASN145、GLN103、GLN117 和GLU96 分别形成了2.64 Å、2.22 Å、2.49 Å、2.78 Å、2.26 Å 和2.26 Å 的氢键相互作用；与TNF 的氨基酸残基GLU104 形成2.30 Å 的氢键相互作用；与STAT3 的氨基酸残基PRO256 形成2.25 Å 的氢键相互作用（图5）。综上，穿心莲内酯和IL6、TNF 和STAT3 的相互作用以氢键为主，且主要通过氢键作用锁定结合取向。

图4 穿心莲内酯与IL-6、TNF和STAT3对接三维图Figure 4 Three-dimensional diagram of andrographolide docking with IL-6，TNF and STAT3

图5 穿心莲内酯与IL6、TNF和STAT3对接二维图Figure 5 Two-dimensional diagram of andrographolide docking with IL6，TNF and STAT3

表3 穿心莲内酯-核心靶点分子对接结合能Table 3 Docking binding energy of andrographolide-core target molecule

4.5 穿心莲内酯对大鼠一般状态和体质量的影响

在实验期间，空白组大鼠反应灵敏，毛发有光泽，饮食和活动都正常。腹腔注射5-Fu 后，模型组大鼠呈现腹泻、进食减少、体质量下降、毛发无华、动作迟钝及精神颓靡等状态。穿心莲内酯低剂量组大鼠和模型组状态相近，高剂量组和阳性对照组均有不同程度的改善，给药过程无动物死亡。

体质量是评价大鼠健康情况的重要指标。本研究中空白组大鼠的体质量呈现不断上升状态，其他各组大鼠体质量在给予5-Fu 后均有不同程度下降（图6），模型组大鼠体质量下降率为（11.37±1.53）%，阳性对照组体质量下降率为（8.10±0.92）%（P<0.05），穿心莲内酯低剂量组体质量下降率为（9.68±1.49）%，穿心莲内酯高剂量组体质量下降率为（7.20±1.73）%（P<0.01），结果表明穿心莲内酯高剂量组的大鼠体质量下降情况得到明显缓解。

图6 穿心莲内酯对各组大鼠体质量的影响Figure 6 Effect of andrographolide on rat body mass in each group(,n=7)

4.6 穿心莲内酯对大鼠腹泻情况的影响

腹腔注射5-Fu 后第1 天到第6 天的腹泻情况如图7所示，空白组大鼠整个过程都无腹泻发生，模型组大鼠从造模24 h 后开始出现腹泻情况，大便状态从干便变成湿便，第6天时，个别大鼠出现水样便和明显的肛周着色，腹泻情况显著（P<0.05）。相较于模型组，穿心莲内酯给药组展现出不同程度的腹泻症状改善，阳性对照组和穿心莲内酯高剂量组在第6天腹泻症状减轻，腹泻评分明显下降（P<0.05），此外，在解剖时观察到阳性对照组和穿心莲内酯高剂量组大鼠肠道中仍有明显成型的粪便，说明穿心莲内酯能改善化疗所致的腹泻症状，起到预防保护作用。

图7 穿心莲内酯对大鼠腹泻情况的影响Figure 7 Effect of andrographolide on diarrhea in rats（，n=7）

4.7 穿心莲内酯对大鼠免疫能力的影响

结果如表4 所示，模型组大鼠的肝脏指数较空白组明显下降，脾脏指数亦明显下降。给予穿心莲内酯服用后，其肝脏指数和脾脏指数均有好转，高剂量穿心莲内酯组大鼠的肝脏指数为39.24±4.45，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05），结果表明，穿心莲内酯对化疗所致肠黏膜炎的大鼠肝脏和脾脏损害具有一定缓解作用。

表4 各组大鼠的脏器指数Table 4 Organ index of rats in each group（，n=7）

表4 各组大鼠的脏器指数Table 4 Organ index of rats in each group（，n=7）

与空白组比较：#P<0.05；与模型组比较：*P<0.05。

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4.8 穿心莲内酯对大鼠回肠组织的影响

各组大鼠小肠组织病理形态变化如图8 所示，空白组大鼠小肠组织结构正常，肠黏膜结构完整，肠腺清晰，上皮细胞排列整齐，隐窝结构保持完整且排列规则；与空白组相比，模型组大鼠肠绒毛萎缩甚至脱落，上皮细胞有空泡形成，隐窝结构破坏，隐窝深度增加，绒毛高度减小，炎性细胞浸润严重；与模型组相比，各给药组肠上皮细胞和隐窝的形状结构呈现不同程度的改善，阳性对照组和穿心莲内酯高、低剂量组大鼠小肠上皮细胞形态相对完整，肠绒毛高度增加，隐窝深度减小，表明穿心莲内酯对5-Fu 所致化疗性肠黏膜炎大鼠小肠病理损伤有一定的保护作用。

图8 大鼠回肠组织病理切片（40×）Figure 8 Pathological sections of rat ileum tissue（40×）

4.9 穿心莲内酯对血清中炎症因子水平的影响

如图9 所示，模型组大鼠血清中IL-6 和TNF-α水平明显高于空白组，阳性对照组和穿心莲内酯高、低剂量组大鼠血清中IL-6 和TNF-α水平较模型组均显著下降（P<0.05）。

图9 穿心莲内酯对大鼠血清中IL-6和TNF-α含量的影响Figure 9 Effect of andrographolide on the content of IL-6 and TNF-α in rat serum（，n=7）

5 讨论

本研究采用网络药理学方法预测穿心莲内酯治疗5-Fu 诱导的大鼠化疗性肠黏膜炎的靶点，PPI网络结果表明，IL-6、TNF 和STAT3 等20 个核心靶点可能是其治疗化疗性肠黏膜炎的关键作用靶点。TNF 是一种重要的参与全身炎症的细胞信号蛋白，在协调炎症免疫反应中起着核心作用，可促使其他炎症因子（如IL-6、IL-1、IL-8 等）的产生[10-11]。IL-6可通过IL-6/STAT3 信号途径诱导STAT3 磷酸化，而STAT3 自身则诱导抗凋亡因子bcl-xl 和bcl-2，进而诱导T 细胞抗凋亡，T 细胞抗凋亡所累积的循环作用则会导致慢性炎症[12-13]，因此，穿心莲内酯可能通过抑制TNF、IL-6 和STAT3 的表达发挥抗炎作用。KEGG 和GO 富集分析结果表明，穿心莲内酯抗化疗性肠黏膜炎的机制主要与炎症和凋亡相关的信号通路和生物学过程有关，如HIF-1 信号通路、TNF 信号通路、Toll 样受体信号通路、T 细胞受体信号通路、氧化应激反应、MAPK 级联的正调控和细胞对化学应激的反应等生物过程。分子对接的结果显示，穿心莲内酯与IL-6、TNF 和STAT3 对接的结合能均小于-5 kcal/mol，说明穿心莲内酯与IL-6、TNF 和STAT3 均能较好地结合，从而减轻机体的炎症反应。

为进一步验证网络药理学的结果，本研究通过5-Fu 诱导大鼠化疗性肠黏膜炎体内模型考察穿心莲内酯的作用及其对炎症因子的影响。动物实验表明，穿心莲内酯能够较好地改善5-Fu 诱导的大鼠化疗性肠黏膜炎，显著改善大鼠体质量、腹泻情况和病理组织损伤，增加肝脏和脾脏指数，降低血清中促炎因子水平，此结果与文献报道穿心莲内酯可作用于p38 MAPK 信号通路改善化疗性肠炎是一致的[9]。在穿心莲内酯治疗大鼠脓毒症研究中发现穿心莲内酯抗炎机制和NF-κB 信号通路相关联，穿心莲内酯可通过抑制NF-κB 信号通路从而阻断炎症因子如IL-6 的产生[14]。本研究中，穿心莲内酯可以明显降低大鼠血清中的IL-6、TNF-α炎症因子水平，缓解肠黏膜损伤，这与网络药理学分析的靶点预测和KEGG 通路富集分析结果一致。

综上所述，本研究采用网络药理学和分子对接技术，并结合动物实验，发现穿心莲内酯可能通过作用于IL6、TNF 等核心靶点减轻炎症反应，发挥治疗化疗性肠黏膜炎的作用，具体的作用机制有待进一步研究。