狼疮肾炎患者血清lncRNA TUG1、miR-144的表达及其意义

江丹,熊金河,尚华,汪佳利,何芳

狼疮肾炎(lupus nephritis,LN)是系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)最常见和最重要的并发症,40%～60%的SLE患者在发病初期即合并LN,是导致SLE患者发展为终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)和死亡的重要原因[1-2]。及时、准确地评估LN肾脏预后,对促进患者预后改善非常重要。炎性反应在LN发生发展中扮演重要角色[3],研究表明,长链非编码核糖核酸(long non-coding ribonucleic acid,LncRNA)、微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)等非编核糖核酸能通过调控炎性反应参与LN发生发展[4]。lncRNA牛磺酸上调基因1(taurine up-regulated gene 1,TUG1)是新近发现的一种lncRNA, lncRNA TUG1在SLE患者外周血中低表达[5]。miR-144是一种炎性相关miRNA,能通过影响靶蛋白稳定性和状态发挥抗炎作用[6]。有学者指出,miR-144在免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)A肾病患者尿沉渣中高表达[7]。然而关于LN患者血清lncRNA TUG1、miR-144表达与预后的关系尚未明确,基于此,现分析LN患者血清lncRNA TUG1、miR-144表达与预后的关系,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020年1月—2021年6月遂宁市中心医院风湿免疫科收治的LN患者104例为LN组,男17例,女87例;年龄18～55岁,中位数26.00(19.00,34.00)岁;病程1～22年,中位数7.5(4.00,12.00)年;病理分型[8]:Ⅱ型8例,Ⅲ型20例,Ⅳ型24例,Ⅴ型28例,Ⅲ型+Ⅴ型11例,Ⅵ型+Ⅴ型13例;慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)分期[9]:1期40例,2期24例,3期28例,4期12例。另选取医院同期体检健康者40例为健康对照组,男7例、女33例;年龄18～55岁,中位数27.00(19.25,35.75)岁。2组性别、年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究已经获得医院伦理委员会批准(KYLLKS20230114) ,受试者或家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:① LN符合《中国狼疮肾炎诊断和治疗指南》[10]诊断标准;②年龄≥18岁;③行肾穿刺活检术;④CKD分期1～4期。(2)排除标准:①药物性狼疮等继发性LN;②确诊时已经处于CKD分期5期ESRD或已经接受肾移植、透析治疗;③合并恶性肿瘤;④合并类风湿性关节炎、紫癜、炎性肠病等其他自身免疫性疾病;⑤临床资料和随访资料缺失;⑥妊娠及哺乳期妇女;⑦合并心、肝、肺等其他脏器严重功能损害。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血清lncRNA TUG1、miR-144表达检测:收集LN患者入院次日和健康对照组体检时静脉血3 ml,离心留取上层血清置于-80℃冰箱中保存待测。使用生工生物工程(上海)股份有限公司(货号B511321-0100)提供的TRIzol试剂盒提取血清总RNA,使用宝日医生物技术(北京)有限公司提供的TaKaRa逆转录试剂盒(货号 6160)将RNA逆转录为cDNA。然后使用赛默飞世尔科技(中国)有限公司生产的7500型聚合酶链式反应扩增仪,按照实时荧光定量聚合酶链式反应试剂盒(货号 10928042)说明书进行扩增。由新贝(上海)生物科技有限公司设计和合成引物,反应总体积:cDNA 1 μl、上下游引物各2.5 μl、2×Hieff®Robust PCR Master Mix 10 μl 、ddH2O加至总体积25 μl ;循环参数:94℃ 3 min 1次,94℃ 10 s、55℃ 20 s、72℃ 30 s,共计35次。lncRNA TUG1上游引物5'-CTGAAGAAAGGCAATCCATC-3'、下游引物5'-GTAGGCTACTACAGGTCATTTG-3';GAPDH上游引物5'-GTCGGAGTCAACGGATTTG-3'、下游引物5'-TGGGTGGAATCATATTGGAA-3';miR-144上游引物5'-GCGCGCTACAGTATAGATGATG-3'、下游引物5'-GCTGTCAACGATACGCTACG-3';U6上游引物5'-CCATCGGAAGCTCGTATACGAAATT-3'、下游引物5'-GGCCTCTCGAACTTGCGTGTCAG-3'。lncRNA TUG1以GAPDH为内参,miR-144以U6为内参,2-ΔΔCT法计算血清lncRNA TUG1、miR-144相对表达量。

1.3.2 随访和分组:通过门诊或电话方式对LN患者随访2年,随访截至2023年6月或ESRD发生。ESRD定义为估算肾小球滤过率(estimate glomerular filtration rate,eGFR)<1 5 ml·min-1·1.73 m-2或透析或肾移植[9]。根据是否发生ESRD将LN患者分为预后不良亚组和预后良好亚组。

2 结 果

2.1 2组血清lncRNA TUG1、miR-144表达比较 LN组患者血清lncRNA TUG1表达低于健康对照组,miR-144表达高于健康对照组(P<0.01),见表1。

表1 健康对照组与LN组血清lncRNA TUG1、miR-144表达比较

2.2 LN亚组患者临床/病理特征比较 随访2年,LN患者104例中发生ESRD 36例(34.62%)。2亚组患者性别、年龄、肾穿刺时病程、并发疾病、病理分型等资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。预后不良亚组患者CKD 3～4期比例、血肌酐、血尿素氮、miR-144高于预后良好亚组,eGFR、lncRNA TUG1和诱导治疗后完全缓解比例低于预后良好亚组(P<0.05或P<0.01),见表2。

表2 预后不良亚组及预后良好亚组LN患者临床/病理特征比较

2.3 LN患者血清lncRNA TUG1与miR-144表达的相关性 经TargetScan网站预测,lncRNA TUG1与miR-144存在结合位点(见图1)。Pearson相关性分析显示,LN患者血清lncRNA TUG1与miR-144表达呈负相关(r=-0.797,P<0.001)。

图1 lncRNA TUG1与miR-144的结合位点示意图

2.4 LN患者预后不良的多因素Logistic回归分析 以LN患者预后不良为因变量(赋值:是为“1”,否为“0”),以上述结果中P<0.05项目为自变量,进行多因素Logistic回归分析,结果显示,CKD分期4期和miR-144升高为LN患者肾脏预后不良的独立危险因素,诱导治疗后完全缓解和eGFR、lncRNA TUG1升高为独立保护因素(P<0.05),见表3。

表3 LN患者预后不良的多因素Logistic回归分析

2.5 血清lncRNA TUG1、miR-144表达预测LN患者肾脏预后不良的价值 绘制血清lncRNA TUG1、miR-144表达预测LN患者肾脏预后不良的ROC曲线,并计算AUC,结果显示:血清lncRNA TUG1、miR-144表达与二项联合预测LN患者肾脏预后不良的AUC分别为0.772、0.773、0.911,二项联合预测的AUC最大(Z=3.239、3.247,P均=0.001),见表4、图2。

图2 血清lncRNA TUG1、miR-144表达预测LN患者肾脏预后不良的ROC曲线Fig.2 ROC curves of serum lncRNA TUG1 and miR-144 expression predicting poor renal prognosis in LN patients

表4 血清lncRNA TUG1、miR-144表达预测LN患者肾脏预后不良的价值

3 讨 论

SLE是由环境、遗传、性激素等多因素引起的一种系统性自身免疫性疾病,以体内存在大量自身抗体、反复复发与缓解、全身多系统多脏器受累为主要临床特点,能通过循环、原位免疫复合物沉积途径、非免疫复合物途径或肾血管病变损伤引起肾脏损伤导致LN[10]。尽管近年来LN诊治取得一定进展,患者预后得以较大的改善,但现阶段诱导治疗方案对增殖性LN完全缓解率仍然较低,且LN具有反复复发的特点,导致较多患者仍然会发展为ESRD,增加死亡风险[11]。LN异质性高,不同患者临床表现、治疗反应和预后具有个体差异,因此有必要寻找简便方法对LN患者肾脏预后进行判断,对促进LN患者肾脏预后改善具有重要意义。

研究证实炎性级联反应在LN中发挥重要作用,SLE引起的循环免疫复合物或原位形成的免疫复合物沉积能激活补体系统,引起炎性细胞浸润和炎性介质释放,损伤肾小球足细胞、肾血管、肾小管间质等导致LN,随着肾损害加重最终导致ESRD[12]。新近研究表明,表观遗传参与LN发生发展,其中lncRNA能直接或通过海绵miRNA调控基因表达,进而参与LN过程[13]。lncRNA TUG1是位于人染色体22q12.2上的一个lncRNA,既往研究多报道其在恶性肿瘤中的作用,近年研究发现lncRNA TUG1还在哮喘、溃疡性结肠炎等免疫疾病中发挥重要作用[14-15]。卢发菊等[16]实验报道,lncRNA TUG1能靶向miR-199a-3p减轻高糖诱导的足细胞炎性反应。Wang等[17]实验报道,上调lncRNA TUG1能靶向核因子红细胞2相关因子2/血红素氧合酶1途径减轻脓毒症诱导肾脏炎性反应,进而抑制急性肾损伤发生。上述研究表明,lncRNA TUG1与肾脏损伤有关。同时既往Cao等[5]研究指出,SLE患者外周血lncRNA TUG1低表达。因此推测lncRNA TUG1可能参与LN过程。本研究结果显示,LN患者血清lncRNA TUG1表达降低,血清lncRNA TUG1表达升高为LN患者肾脏预后不良的独立保护因素,这说明血清lncRNA TUG1表达升高能降低LN患者肾脏预后不良风险。其原因可能是lncRNA TUG1高表达能靶向抑制核因子-κB信号通路活化,抑制肾脏炎性细胞浸润和炎性介质释放,避免炎性级联反应对肾脏的损伤,从而降低LN患者肾脏预后不良风险[18]。

miRNA也是表观遗传的重要一环,能通过与靶基因完全或不完全互补调控基因表达,进而参与LN过程[19]。miR-144是位于人染色体17q11.2上的一个miRNA,是多种恶性肿瘤的抑制基因,近年研究发现miR-144也参与骨关节炎、类风湿性关节炎等免疫疾病过程[20]。Min等[21]实验报道,上调miR-144能促进白介素- 1β、白介素-6、肿瘤坏死因子-α等炎性因子和B细胞淋巴瘤/白血病-2表达,进而促进肾细胞炎性反应和凋亡。Xu等[22]实验报道,上调miR-144能激活Wnt/β-连环蛋白通路,进而促进大鼠肾细胞凋亡。上述研究表明,miR-144对肾脏具有重要的保护作用。重要的是,IgA肾病同LN一样也属于免疫性肾病,由免疫系统功能紊乱引起免疫复合物沉积于肾脏所致[23]。而Duan等[7]研究指出,IgA肾病患者尿沉渣中miR-144高表达。因此推测miR-144可能参与LN过程。本研究结果显示,LN患者血清miR-144表达升高,为LN患者肾脏预后不良的独立危险因素,这说明血清miR-144表达升高会增加LN患者肾脏预后不良风险。其原因可能是miR-144高表达能激活Wnt/β-连环蛋白通路,导致免疫系统紊乱,促进肾脏炎性细胞浸润和炎性介质释放,加重肾脏功能和结构破坏,进而增加LN患者肾脏预后不良风险[24]。

本研究通过网站预测发现,lncRNA TUG1与miR-144存在结合位点,进一步分析发现lncRNA TUG1与miR-144在LN患者血清中表达呈负相关,提示lncRNA TUG1与miR-144可能共同影响LN病情进展。最近马洪波等[25]实验也报道,上调lncRNA TUG1能靶向吸附miR-144,进而抑制LN小鼠肾小球系膜细胞炎性反应,进一步佐证了本研究结果。本研究结果还显示,CKD分期4期、诱导治疗后完全缓解和eGFR也能独立影响LN患者肾脏预后,其原因可能是CKD分期4期和eGFR降低反映LN患者肾脏损伤更严重,因此肾脏预后不良风险更高;诱导治疗后完全缓解提示诱导治疗对LN有效,能更好地抑制炎性反应发展,进而降低肾脏预后不良风险。最后本研究通过绘制ROC曲线发现,血清lncRNA TUG1、miR-144表达为0.55、1.38时,预测LN患者肾脏预后不良的AUC为0.772、0.773;血清lncRNA TUG1、miR-144表达联合预测的AUC为0.911,大于lncRNA TUG1、miR-144单独预测。说明检测血清lncRNA TUG1、miR-144表达有助于LN患者肾脏预后不良预测,且联合检测血清lncRNA TUG1、miR-144表达能提升预测价值。但本研究结果还需多中心研究进一步验证。

综上所述,LN患者血清lncRNA TUG1表达降低,miR-144表达升高,二者可能共同影响LN肾脏预后,是LN患者肾脏预后不良的独立影响因子。血清lncRNA TUG1、miR-144表达联合检测对LN肾脏预后不良的预测价值较高。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

江丹、何芳:设计研究方案,实施研究过程,论文撰写;熊金河、尚华:提出研究思路,分析试验数据,论文审核;汪佳利:进行统计学分析