番茄红素调节RAS同源基因家族成员A/Rho相关激酶信号通路对氧化低密度脂蛋白诱导脑血管内皮细胞凋亡的影响

张君臣, 徐武华, 钟 丽

[1. 四川省中江县人民医院 神经内科, 四川 德阳, 618100; 2. 暨南大学附属广州红十字会医院康复医学科(神经内科二区), 临床病态营养研究所, 广东 广州, 510220;3. 四川省宜宾市第二人民医院, 四川 宜宾, 644002]

动脉粥样硬化(AS)最初由内皮功能障碍引发,其特征是致AS脂蛋白成分的流入[1]。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)已被证明参与AS的形成过程,其诱发的血管内皮细胞(EC)损伤是AS的早期发病机制之一[2]。减少ox-LDL诱导的EC损伤并进一步解释其机制可能是预防和治疗AS的潜在策略。番茄红素(LYC)是一种广泛使用的抗氧化剂,可以修复动物生物体和细胞的氧化损伤。LYC对多种类型的疾病具有预防或治疗作用,例如心脑血管疾病、癫痫、癌症等[3]。研究[4]发现, LYC可通过减轻过氧化氢(H2O2)激活的内皮细胞氧化损伤,并抑制细胞凋亡,有助于预防AS。GUO W H等[5]发现, LYC可减轻氧化应激诱导的人EC损伤。

RAS同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关激酶(ROCK)信号通路是研究AS的重要通路,抑制RhoA/ROCK信号通路可有效改善慢性间歇性缺氧(IH)加重的内皮屏障损伤和AS[6]。BABAAHMADI-REZAEI H等[7]研究发现, RhoA/ROCK信号通路抑制剂可以减少蛋白多糖合成和AS斑块的形成, ROCK抑制剂可能在抑制或减缓AS形成方面具有潜在的治疗作用。LYC是否可以通过调控RhoA/ROCK信号通路对人脑微血管内皮细胞(HBMECs)产生影响还尚无报道。本研究探讨LYC是否可以通过抑制RhoA/ROCK信号通路对HBMECs细胞凋亡产生影响,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究材料

HBMECs购自武汉赛奥斯生物科技有限公司; RhoA/ROCK信号通路激活剂溶血磷脂酸(LPA)购自深圳市健竹科技有限公司; LYC购自上海源叶生物科技有限公司; ox-LDL购自广州奕源生物科技有限公司; 单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)购自武汉菲恩生物科技有限公司,人白细胞介素(IL)-6试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司; 血管内皮细胞黏附分子1(VCAM-1)试剂盒购自上海生工; Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自弗元(上海)生物科技有限公司; CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司; 兔抗人RhoA一抗、兔抗人ROCK1一抗、兔抗人BCL-2相关X蛋白(Bax)一抗、兔抗人B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)一抗、兔抗人裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-Caspase-3)一抗、兔抗人血小板内皮细胞黏附分子-1(CD31)一抗、兔抗人平滑肌(SM)22α一抗、兔抗人GAPDH抗体均购自英国Abcam公司。

1.2 细胞培养及分组

将HBMECs置于37 ℃、5%CO2的培养箱中,在补充有5%FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的EGM-2培养基中培养。采用50 mg/mL ox-LDL处理HBMECs[8],将采用ox-LDL处理的HBMECs分为ox-LDL组、LYC组(0.5 μmol/L LYC处理HBMECs)[5]、LPA组(5 μmol/L RhoA/ROCK信号通路激活剂LPA处理HBMECs)[9]、LYC+LPA组(0.5 μmol/L LYC以及5 μmol/L LPA共同处理HBMECs), 未做任何处理的HBMECs记为NC组,处理24 h后用于后续实验。

1.3 观察指标

① 采用ELISA试剂盒检测HBMECs中MCP-1、IL-6、VCAM-1的水平。② 采用CCK-8法检测HBMECs增殖情况。将HBMECs接种在96孔板上(1×104个/孔),分组处理24 h后,添加10 μL CCK-8在37 ℃下孵育2 h。采用微孔板读取器测量450 nm处的吸光度。③ 采用流式细胞术检测HBMECs凋亡率。收集各组HBMECs, 结合缓冲液重悬后(1×105个/mL), 添加10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI, 并在室温下黑暗中进行反应15 min。采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。细胞凋亡率是根据第2、4象限数据相加统计。④ Western blot检测细胞CD31、SM22α、Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3、RhoA/ROCK通路相关蛋白表达。采用RIPA裂解缓冲液裂解每组中的HBMECs。采用12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的蛋白质,然后转印到PVDF膜上。将膜与5%脱脂乳缓冲液孵育1 h以防止非特异性结合,然后与一抗孵育: RhoA(1∶1 000)、ROCK1(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、cleaved-Caspase-3(1∶5 000)、Bcl-2(1∶500)、CD31(1∶1 000)、SM22α(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)抗体。在洗涤后,采用过氧化物酶偶联的二级抗体(1∶1 000)孵育1 h后,通过增强型化学发光检测试剂检测膜中的蛋白质条带,并通过Image J软件检测目的条带灰度值。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 LYC对细胞MCP-1、IL-6、VCAM-1水平的影响

与NC组相比, ox-LDL组MCP-1、IL-6、VCAM-1水平增高; 与ox-LDL组相比, LYC组MCP-1、IL-6、VCAM-1水平降低, LPA组MCP-1、IL-6、VCAM-1水平升高; 与LYC组相比, LYC+LPA组MCP-1、IL-6、VCAM-1水平升高; 上述组间差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 LYC对细胞MCP-1、IL-6、VCAM-1水平的影响 pg/mL

2.2 LYC组对细胞增殖的影响

与NC组相比, ox-LDL组OD值降低; 与ox-LDL组相比, LYC组OD值升高, LPA组OD值降低; 与LYC组相比, LYC+LPA组OD值降低; 上述组间差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 LYC组对细胞增殖的影响

2.3 LYC对细胞凋亡率以及凋亡蛋白水平的影响

与NC组相比, ox-LDL组HBMECs凋亡率及Bax、cleaved-Caspase-3水平增高, Bcl-2蛋白水平降低; 与ox-LDL组相比, LYC组HBMECs凋亡率及Bax、cleaved-Caspase-3水平降低, Bcl-2蛋白水平升高,而LPA组HBMECs凋亡率及Bax、cleaved-Caspase-3水平升高, Bcl-2蛋白水平降低; 与LYC组相比, LYC+LPA组HBMECs凋亡率及Bax、cleaved-Caspase-3水平增高, Bcl-2蛋白水平降低; 上述组间差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1、图2、表3。

表3 LYC对细胞凋亡率、凋亡相关蛋白表达的影响

2.4 LYC对细胞CD31、SM22α蛋白水平的影响

与NC组相比, ox-LDL组细胞CD31蛋白水平下降, SM22α蛋白水平增加; 与ox-LDL组相比, LYC组CD31蛋白水平升高, SM22α蛋白水平降低,而LPA组CD31蛋白水平降低, SM22α蛋白水平升高; 与LYC组相比, LYC+LPA组细胞CD31蛋白水平下降, SM22α蛋白水平升高; 上述组间差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3、表4。

表4 LYC对细胞中CD31、SM22α蛋白表达的影响

2.5 LYC对细胞RhoA/ROCK信号通路蛋白水平的影响

与NC组相比, ox-LDL组RhoA、ROCK1蛋白水平上调; 与ox-LDL组相比,LYC组RhoA、ROCK1蛋白水平下调,而LPA组RhoA、ROCK1蛋白水平上调; 与LYC组相比, LYC+LPA组RhoA、ROCK1蛋白水平上调; 上述组间差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4、表5。

表5 LYC对细胞RhoA/ROCK信号通路蛋白水平的影响

3 讨 论

AS是脑血管疾病的主要原因,其患病率较高,已成为全球关注的健康问题[10-11]。内皮损伤和细胞凋亡是AS的主要病理过程,会引发血栓形成并加速AS斑块的形成[12-14]。ox-LDL既是AS的触发因素,也是AS的标志[15]。ox-LDL被巨噬细胞和动脉EC吸收,促进泡沫细胞的形成和EC损伤。早期研究[16]发现, ox-LDL通过激活Caspase-3级联反应诱导EC凋亡。EC过度凋亡是AS发展的初步事件,可能是预防和治疗AS的目标。研究[17]表明,天然药物通过抑制EC凋亡来治疗AS具有巨大的潜力。LYC在AS的许多阶段具有积极作用[18]。LIU H等[19]发现, LYC通过抑制肠道胆固醇吸收表现出潜在的抗AS作用。LYC具有抗氧化活性,可以减少AS斑块形成[20]。DUAN H等[17]也发现LYC可以通过抑制EC凋亡来治疗AS。上述研究提示, LYC可能是治疗AS的潜在治疗药物。本研究发现, ox-LDL处理后HBMECs的OD值显著下降,而LYC处理使HBMECs细胞OD值显著升高,提示LYC可能促进HBMECs的生长,对AS的治疗起到积极影响。

ox-LDL通过诱导血管内皮炎症和细胞凋亡来促进AS斑块的形成和发展。ox-LDL对血管壁的损伤表现为促进脂质沉积、炎症反应,释放金属蛋白酶,促进EC、巨噬细胞和血管平滑肌细胞凋亡[21]。在动脉壁的受伤区域发现了大量的ox-LDL积累,并且发现血管EC凋亡[22]。Bax、Bcl-2和Caspase-3在ox-LDL诱导的HUVEC中表达异常,这与ox-LDL诱导的EC损伤反应有关。此外, ox-LDL可加速MCP-1、IL-6、VCAM-1和ICAM-1等黏附分子的表达[23]。正常EC对促炎因子的反应是发生内皮-间充质转化(EndMT), 其特征是成纤维细胞样形态和细胞间连接重排[24]。在各种血管病变中, EC可能通过下调内皮标志物CD31 和上调 SM22α来经历EndMT的表型转换[25]。研究[26]表明, EndMT在心脑血管疾病的发病机制中起着关键作用,抑制EndMT可以对AS治疗起到积极效果。本研究发现, ox-LDL诱导的HBMECs凋亡率、MCP-1、IL-6、VCAM-1、Bax、cleaved-Caspase-3、SM22α水平显著升高, Bcl-2、CD31水平显著下降,而LYC治疗后HBMECs凋亡率、MCP-1、IL-6、VCAM-1、Bax、cleaved-Caspase-3、SM22α水平显著降低, Bcl-2、CD31水平显著升高,表明ox-LDL促进了HBMECs凋亡以及EndMT过程的发生, LYC可能通过抑制HBMECs炎症因子水平、EndMT以及细胞凋亡来对HBMECs损伤起到保护作用。

研究[27]显示RhoA/ROCK通路是一种重要的信号转导系统,参与细胞增殖、内皮功能障碍、氧化应激、炎症、血管重塑和AS。既往研究[28]表明, AS的各种危险因素和病理介质可以不同程度地激活RhoA/ROCK通路,并且抑制RhoA/ROCK通路可能是AS治疗的潜在机制。此外, RhoA/ROCK通路对AS过程炎症反应的调节作用已被研究[29]证实。本研究结果显示, ox-LDL促进细胞RhoA、ROCK1蛋白高表达,而LYC治疗后细胞RhoA、ROCK1蛋白水平显著下降,表明ox-LDL可能通过下调RhoA/ROCK信号通路抑制HBMECs凋亡的发生。本研究使用RhoA/ROCK信号通路激活剂LPA处理ox-LDL诱导的HBMECs以及LYC治疗后的HBMECs,结果发现LPA加重了ox-LDL诱导的HBMECs损伤,但减弱了LYC对ox-LDL诱导的EC凋亡的抑制作用。

综上所述, LYC可能通过下调RhoA/ROCK信号通路抑制HBMECs凋亡以及EndMT, 对HBMECs损伤起到改善效果。