电针“后三里”结合四君子汤对奥沙利铂致周围神经病变大鼠坐骨神经传导速度及NGF的影响

熊 啸,徐天舒

(1.南京中医药大学中西医结合鼓楼临床医学院,江苏 南京 210008;2.南京大学医学院附属鼓楼医院,江苏 南京 210008)

奥沙利铂作为第三代铂类抗肿瘤药物,具有高效、低毒和广谱的特点,广泛用于消化道肿瘤[1]。然而,奥沙利铂诱导的周围神经病变(OIPN)是临床常见的不良反应,发病率高达85%[2],表现为不同程度的感觉异常、感觉弱化,会降低患者药物耐受性,诱发患者焦虑抑郁等情绪,持续影响患者的生活质量[3]。OIPN发病机制复杂,主要与奥沙利铂蓄积于背根神经节[4]、线粒体功能损伤导致氧化应激[5]、离子通道活性改变、免疫过程和神经炎症[6]等因素有关。目前研究有神经保护剂、离子通道靶向剂及抗氧化剂等[7]相关药物,但均无支持性证据;临床针对出现疼痛的OIPN患者以止痛、抗抑郁的对症治疗为主,缺乏特异性,疗效不甚理想。中医不论是针灸、中药均对OIPN具有较好的治疗效果[8-10],常单独作用或联合西药进行治疗。针灸治疗包括电针、温针灸及艾灸等,中药常用治疗药物包括健脾益气、补肾健脾等[11]药物。然而,既往研究仅限于验证中医治疗的有效性,或者不同针灸治疗手段、不同补益药物的治疗效果有所区别;关于针灸、中药的疗效对比以及针药结合是否具有更好的治疗作用目前尚不明确。因此,本研究建立OIPN大鼠模型,通过观察电针“后三里”、中药四君子汤灌胃及针药结合3种治疗方法对OIPN大鼠机械性缩足阈值、坐骨神经传导速度及其NGF蛋白表达和背根神经节的影响,探讨这3种疗法的效应差异。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康SPF级雄性SD大鼠25只,体质量220～240 g,购自南京医科大学实验动物中心[许可证号:SCXK(苏)2021-0001]。饲养于南京大学附属鼓楼医院实验动物中心,分笼喂养,室温(22±2)℃,湿度40%～60%,明暗12 h交替,垫料每日更换,自由饮食饮水。适应性喂养1周后,采用随机数字表法将大鼠分为空白组、模型组、电针组、中药组和针药结合组,每组5只。实验过程中所有操作严格遵照中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。

1.2 药物及其制备

四君子汤(药物组成:党参、白术和茯苓各9 g,甘草6 g),由江苏省鼓楼医院中药房提供,水煎后浓缩,含生药量3 g/mL,4 ℃冰箱保存。

1.3 试剂与仪器

1.3.1 试剂 奥沙利铂(13081211,江苏恒瑞医药股份有限公司);异氟烷(9020000522,深圳市瑞沃德生命科技有限公司);BCA 蛋白含量检测试剂盒(FMS-W-002,福麦斯生物科技有限公司);RIPA裂解液(FMS-WB035,福麦斯生物科技有限公司);PVDF膜(IPVH00010);SDS-PAGE凝胶配置试剂盒(P0012A,上海碧云天生物技术有限公司);鼠抗神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)抗体(EP1320Y,英国Abcam);GAPDH一抗(5174T,CST);羊抗兔二抗(FMS-Rb01,福麦斯生物科技有限公司);ECL化学发光试剂盒(WBKLS0500)。

1.3.2 仪器 针灸毫针(GB2024-94,苏州医疗用品有限公司);Von-Frey纤维丝(DanMic Global, 美国LLC公司);小动物专用吸入麻醉机(VMR,美国MATRX公司);PowerLab数据采集分析系统(澳大利亚AD Instruments公司);电泳仪、转膜仪(美国Bio-Rad);正置荧光显微镜、石蜡切片机(德国Leica)。

1.4 造模方法

除空白组外,其余组大鼠参照文献[12]腹腔注射奥沙利铂溶液制备OIPN大鼠模型。将 OXA(规格为:50 mg/瓶)在 5%葡萄糖溶液中充分溶解,终浓度为1 mg/mL,现配现用。大鼠予以2 mg/kg的剂量腹腔注射,注射时间点为第1、3、5、8、11与15天共6次注射,建立OIPN模型;造模成功的评价方法:大鼠Von Frey纤维丝机械性刺激痛觉超敏反应阳性,单足缩足≥3次,则造模成功。空白组大鼠腹腔注射等量5%葡萄糖溶液。

1.5 干预方法

造模成功后开始进行治疗。

1.5.1 电针组 参照《实验针灸学》[13]的取穴定位,后三里位于大鼠膝关节后外侧,腓骨小头下约5 mm处,双侧各有一穴位。大鼠固定方式固定,动物吸入式麻醉机以0.35 mL/min异氟烷麻醉大鼠,取双侧“后三里”常规消毒后将针灸针刺入,直刺3～5 mm,连接电针仪正负极,疏密波2 Hz/15 Hz ,强度2 mA刺激20 min。

1.5.2 中药组 将制备好的四君子汤水煎剂温热,参照《中药药理实验方法学》[14]人鼠等效剂量换算,予1 mL/kg灌胃。

1.5.3 针药结合组 先行电针“后三里”治疗,30 min后再中药灌胃,方法同上。

1.5.4 空白组和模型组 给予相同时间的固定,但不予其他处理。各组干预均1次/d,连续14 d。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 机械性缩足阈值 用不同标号Von Frey纤维丝(折力梯度分别为4.0、6.0、8.0、10.0与15.0 g),折合成缩足阈值(分别为4.56、4.74、4.93、5.07与5.18),测定大鼠缩足阈值。将大鼠放置于金属网筛上,盖以透明有机玻璃箱内适应15 min,待其梳理探索活动基本消失、处于静止时,用Von Frey纤维丝垂直刺激大鼠一侧后肢足底中央,力度以纤维丝轻度弯曲为准,持续3～5 s,出现明显抬腿、舔舐足底记为阳性,测定从4.0 g开始,当该力度的刺激无法引起阳性反应时,给予相邻大一级力度的刺激;若出现阳性反应则给予相邻小一级力度的刺激。每一标号测量5次,5次中有3次或3次以上的阳性反应视为有机械痛敏,每次间隔30 s。最大力度15.0 g,大于此值记为15.0 g。于干预第1、5、9与14天测定。

1.6.2 坐骨神经传导速度 最后1次干预后次日予0.35 mL/min异氟烷麻醉大鼠,沿股骨干后缘剪开皮肤、剥离筋膜肌肉,暴露大鼠右侧坐骨神经,用玻璃分针游离坐骨神经,在游离的坐骨神经上放置第一刺激电极,踝部放置第二刺激电极,记录电极位于骨间肌中,给予刺激[15];用LabChart 数据记录分析系统记录动作电位,随后改变坐骨神经上第一刺激电极位置,记录两次刺激电极间距离、动作电位的潜伏期,坐骨神经传导速度=两次刺激电极间距离/两次动作电位潜伏期之差。

1.6.3 组织取材 各组大鼠坐骨神经传导速度测定结束后立即取材,分离右侧坐骨神经剪取2～4 cm,0.9%氯化钠溶液冲洗,经液氮浸泡后冻存于-80 ℃冰箱。过量异氟烷麻醉处死大鼠,取大鼠L1～6脊椎段,取出L4～6背根神经节,置于中性多聚甲醛中固定48 h后进行脱水、石蜡包埋,5 μm切片。

1.6.4 HE染色观察大鼠背根神经节形态学改变 切片脱蜡、水化后苏木素染色5 min,分化液分化,返蓝液返蓝,伊红染色1 min,漂洗后梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固,在光学显微镜下观察背根神经节的形态改变。

1.6.5 Western blot法检测坐骨神经NGF蛋白表达 取冻存的大鼠坐骨神经40 mg,加入裂解液破碎匀浆、离心,取上清液进行蛋白质定量,加入适量上样缓冲液,沸水浴10 min。选择12% PAGE胶电泳,并蛋白转印至硝酸纤维素膜(PVDF)上,5%脱脂奶粉室温封闭1 h后加入稀释的一抗(NGF 1∶1 000, GAPDH 1∶1 000)4 ℃孵育过夜,TBST洗涤后加入稀释的二抗,室温孵育1 h,洗涤后滴加ECL化学发光液,使用全自动数码凝胶图像分析系统拍照,读取相关条带灰度值,以GAPDH为内参计算大鼠坐骨神经NGF蛋白的相对表达。

1.7 统计学处理

采用SPSS 26.0统计软件进行分析。不同时间点各实验组之间的机械痛阈值的比较采用重复测量多因素方差分析,其余统计数据的组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较采用LSD检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况

正常组大鼠精神良好、反应灵敏和进食正常,体质量正常增长;模型组大鼠精神萎靡、反应迟钝、毛发稀疏、活动和进食逐渐减少,体质量增长缓慢甚至体质量减轻;各干预组大鼠精神可、反应稍慢、毛发正常、饮食活动可和体质量缓慢增长。

2.2 各组大鼠机械性缩足阈值比较

干预第1天,模型组、中药组、电针组和针药结合组大鼠Von Frey纤维丝机械性缩足阈值均低于空白组,差异具有统计学意义(P<0.01),模型组、中药组、电针组及针药结合组组间比较差异无统计学意义;干预第5天、9天,中药组、电针组和针药结合组缩足阈值具有升高趋势;第14天,与空白组比较,模型组缩足阈值降低,差异具有统计学意义(P<0.01),与模型组比较,电针组、针药结合组机械性缩足阈值明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),中药组机械缩足阈值低于针药结合组,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠干预第1、5、9与14 d机械性缩足阈值的比较

2.3 各组大鼠坐骨神经传导速度比较

干预结束后,与空白组比较,模型组坐骨神经传导速度明显减慢,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,中药组、电针组和针药结合组坐骨神经传导速度明显提高,差异具有统计学意义(P<0.01)。干预组中针药结合组提高更明显,但3组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠坐骨神经传导速度比较

2.4 各组大鼠坐骨神经NGF表达比较

与空白组比较,模型组坐骨神经中NGF表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,电针组、中药组和针药结合组坐骨神经NGF水平升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。各干预组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

注:与空白组比较,**P<0.01;与模型组比较,##P<0.01。

2.5 各组大鼠背根神经节形态比较

空白组大鼠背根神经节细胞核正常大小、位于细胞中央,无明显空泡。模型组大鼠神经元胞体缩小,细胞内出现较大空泡,细胞核缩小、核仁固缩,多见偏心核、多核仁。与模型组比较,电针组、中药组和针药结合组神经元细胞核形状规则,少见偏心核、多核仁。见图2。

注:A.空白组,B.模型组,C.电针组,D.中药组,E.针药结合组;箭头所示为偏心核、多核仁。

3 讨论

奥沙利铂致周围神经病变(OIPN)是目前肿瘤化疗中常见的不良反应,影响患者后续治疗。根据其感觉异常、肢体麻木的临床症状,可归属于中医理论中“痹证”“血痹”范畴[16]。近年来多项研究显示,无论针灸或者中药均可有效缓解OIPN的神经损伤,在治疗奥沙利铂致周围神经病变方面取得一定进展[17-20],中药可以通过多途径减轻背根神经节神经元损伤、保护周围神经[21];针灸对OIPN具有显著止痛效果[22-23],同时可以修复神经损伤。足三里为足阳明胃经下合穴,具有通经活络、补中益气的作用,“治痿独取阳明”,有多气多血的特点,是后天濡养肌肉的常用穴位,治疗肢体痿痹具有良好的效用。Meta分析显示足三里是治疗CIPN选用频率最高的穴位[24],电针“足三里”可以激活多种免疫细胞、调节神经系统及神经递质的产生[25],通过抑制瞬时电位受体(TRPs)中TRPV1[26]的表达、降低促炎细胞因子的水平[27]来抑制化疗诱导的周围神经病理性疼痛。四君子汤为补脾益气经典方,具有抗肿瘤、提高免疫力和改善肿瘤恶病质的作用[28-29],在防治OIPN方面同样具有一定效果[30],可改善OIPN患者末梢神经功能和血液循环,提高机体免疫功能,预防化疗药物引起的神经损伤[31]。因此,本研究采取电针“后三里”(即足三里)、中药四君子汤和电针结合四君子汤3种不同的干预方法,观察对OIPN大鼠周围神经损伤的修复作用及其可能机制。

本研究结果显示,在干预第5、9天,电针组、中药组及针药结合组机械痛阈值与模型组差异比较无统计学意义(P>0.05),至第14天,电针组、中药组和针药结合组机械痛阈值均大于模型组,其中电针组、针药结合组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。电针组、中药组和针药结合组均可提升OIPN大鼠的坐骨神经传导速度、上调坐骨神经NGF蛋白表达,坐骨神经传导速度检测可以客观反映神经传导功能,定量评价神经损伤程度。实验结果说明,电针“后三里”、四君子汤灌胃及针药结合均可显著提升坐骨神经传导速度并上调其NGF的表达,同时电针、针药结合还可以在第14天有效缓解OIPN大鼠的机械痛敏,电针、针药结合具有较好的缓解疼痛作用,而中药组缓解OIPN痛觉过敏的效果较差。针药结合组治疗效果高于电针组、中药组,但目前差异无统计学意义(P>0.05),这种情况考虑OIPN发病早期主要病因为“药毒”,病机以“瘀阻”为主,经脉瘀阻,肢体疼痛,属于“痹证”, 标实而正气尚未虚衰。而随着奥沙利铂模型周期的增加,第14天左右,OIPN大鼠出现活动减少、不欲饮食、反应迟钝和体重减轻等症状,此时病机以“本虚”为主,脾气亏虚,气血生化乏源,不能充养经脉、肌肉,属“痿证”。足三里、四君子汤均以健脾补气为主,因此前期治疗效果较弱,而后期脾气亏虚,电针、中药和针药结合出现较好的干预作用,针药结合组治疗效果高于电针、中药组,但差异无统计学意义(P>0.05),可能与后期干预时间不够有关,干预效果尚未出现显著性差异。后续可以通过进一步实验验证OIPN大鼠不同时间的中医证型区别,以及增加后期干预时间后针药结合与单纯电针或中药的差异。

NGF在神经损伤、修复和生长中起着重要作用,本研究结果显示电针和中药干预均可改善OIPN大鼠坐骨神经NGF蛋白表达的下调。多项研究[32-34]证明奥沙利铂化疗后患者的血清NGF水平明显下降,且下降程度和临床神经毒性的严重程度高度相关。在细胞模型中,给予高剂量的外源性NGF可以有效改善奥沙利铂诱导的背根神经节神经元凋亡[35]。背根神经节作为奥沙利铂的主要损伤靶点,铂蓄积于背根神经节引起氧化应激和凋亡通路激活,导致慢性神经毒性。这种损伤在组织学形态上主要表现为神经元直径减小、大神经元相对比例减少,细胞核边界模糊、核仁形态不规则,出现偏心核、多核仁[36],并推测这种神经元萎缩的改变可能是神经传导速度下降的形态学基础[37]。本研究结果同样证明,奥沙利铂诱导的周围神经病变会导致大鼠坐骨神经NGF表达下调,背根神经节神经元萎缩、细胞核形态不规则。通过电针和四君子汤干预可以上调NGF表达,改善背根神经节神经元病理性改变、修复神经元损伤,从而提升坐骨神经传导速度,减轻外周神经病变程度。

综上,电针“后三里”、中药四君子汤和针药结合均可以有效改善OIPN大鼠周围神经病变程度,可能是通过上调坐骨神经NGF蛋白的表达、修复背根神经节神经元的损伤,进而提升坐骨神经传导速度,起到保护周围神经的作用。电针、针药结合具有显著的缓解疼痛作用而中药不具有,针药结合治疗未见明显优势。