鞘内注射ZD7288对糖尿病大鼠周围神经痛及血糖的作用

余德芊，马彦巧，雷晓露，刘晓红

(遵义医科大学 基础医学院生理学教研室，贵州 遵义 563099)

超极化激活环核苷酸门控(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide gated，HCN)通道激活时允许Na+内流、K+外流，产生一种内向阳离子电流(Ih电流)，使细胞兴奋性增高。HCN通道包括4种亚型(HCN1-4)，广泛表达于伤害性感觉传导通路，参与了病理性疼痛的发生[1]。背根节(dorsal root ganglion，DRG)为初级感觉传入神经元胞体所在地，研究发现多种亚型HCN通道表达于背根节：HCN1表达于大、中型神经元，HCN2主要分布于感受伤害性刺激的小型神经元，HCN3、HCN4表达较少[2]。既往研究显示背根节HCN1,2通道表达增加促进了病理性疼痛的发生与发展：外周炎性痛和外周神经损伤所致的神经痛模型中，背根节神经元HCN1、HCN2表达增加、Ih幅值增大；给予HCN通道拮抗剂可减小Ih幅值，显著减轻疼痛症状[3-4]。

糖尿病周围神经痛(Diabetes peripheral neuralgia，DPN)在糖尿病患者中发生率高，严重影响患者的身心健康。但DPN发病机制复杂，迄今尚不清楚。最近,Shimatani等[5]发现连续给予丙酮醛(葡萄糖代谢派生物)可激活小鼠外周感觉神经HCN通道，Ih幅度增加，感觉神经兴奋性增高。然而，糖尿病时背根节HCN通道的表达变化及其在DPN发生中的作用目前未见文献报道。本研究采用链脲佐菌素(STZ)诱导大鼠Ⅰ型糖尿病，检测糖尿病大鼠血糖、痛阈值及背根节HCN1,2通道表达变化，观察鞘内给予HCN通道拮抗剂ZD7288对以上指标的影响，探讨背根节HCN通道在DPN发生与发展过程中所起的作用。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂兔抗HCN1多克隆抗体(ab19405)、兔抗HCN2多克隆抗体(ab19346)为Abcam产品；山羊抗β-actin多克隆抗体(60008-1)购自proteintech公司；抗兔IgG-HRP、抗山羊IgG-HRP、STZ、ZD7288为Sigma公司产品。

1.2 动物分组4～5周龄SD大鼠36只购自第三军医大学[许可证号SCXK(渝)20012-0005]。实验分为3组：①对照组(n=12)；②STZ组(鞘内注射生理盐水，n=12)；③ZD7288+ STZ组(鞘内注射ZD7288，n=12)。

1.3 方法

1.3.1 糖尿病神经痛模型制作及鞘内置管参照马彦巧等[6]的方法，于大鼠L4与L5间隙置入PE-10导管。置管7 d 后，单次腹腔注射STZ(60 mg/kg)，72 h后血糖值≥16.7 mmol/L，且2周后热缩足潜伏期明显降低，则糖尿病周围神经痛大鼠制备成功。

1.3.2 血糖测定采用便携式血糖分析仪分别于注射STZ前及注射STZ后3 d，3、4周测定各组大鼠空腹尾静脉血糖。

1.3.3 鞘内给药注射STZ的第3、4周，STZ组大鼠鞘内注射生理盐水20 μL，ZD7288 + STZ组大鼠先鞘内注射5 μLZD7288(含30 μg ZD7288)，再给予15 μL生理盐水。每天1次，连续14 d。

1.3.4 痛行为学鞘内给予ZD7288后2 h时采用热辐射法测定大鼠热缩足潜伏期(thermal withdrawal latency，TWL)，具体方法参照杨舒蕾等[7]。

1.3.5 免疫印迹法检测背根节HCN1,2通道蛋白表达提取各组大鼠L4～L6背根节总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，行SDS- PAGE电泳(每孔加入30 μg蛋白样品)，半干转法将凝胶中蛋白转移至PVDF膜上。5 %脱脂牛奶封闭2 h，分别加入兔抗HCN1多克隆抗体(1∶500)、兔抗HCN2多克隆抗体(1∶500)、山羊抗β-actin多克隆抗体(1∶500)，4℃孵育过夜。PBS洗膜，分别加入抗兔IgG-HRP(1∶1 000)和抗山羊IgG- HRP(1∶1 000)，室温放置1 h。加化学发光试剂显色，于全自动凝胶成像仪中显影，以目的条带与内参(β-actin)条带平均灰度值的比值(%)进行数据统计与分析。

2 结果

2.1 糖尿病周围神经痛大鼠血糖的变化与对照组相比，糖尿病周围神经痛大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)显著升高(>16.7 mM；P<0.01，见图1)，鞘内注射HCN通道拮抗剂ZD7288对糖尿病大鼠FBG无显著影响，说明抑制HCN通道功能对STZ诱导的Ⅰ型糖尿病大鼠的高血糖无明显改善作用。

2.2 糖尿病周围神经痛大鼠痛阈值的改变与对照组相比，腹腔注射STZ 2周后大鼠TWL明显降低，3～4周痛阈值进一步下降(P<0.01，见图2)，说明糖尿病神经痛模型成功建立；鞘内给予30 μgZD7288(我们以往的实验显示鞘内注射30 μgZD7288后2 h镇痛效果佳[7])可显著升高糖尿病大鼠的TWL(P< 0.01，见图2)，表现出良好的镇痛效应。

**：与control组相比，P<0.01；##：与STZ组相比，P<0.01。图2 各组大鼠热缩足潜伏期的变化

2.3 糖尿病周围神经痛大鼠背根节HCN1,2通道表达的变化

2.3.1 背根节HCN1通道表达变化与对照组相比，糖尿病周围神经痛大鼠在注射STZ后第3、4周背根神经节HCN1通道表达显著增加(P< 0.01,见图3)，鞘内给予ZD7288(HCN通道拮抗剂)可降低糖尿病大鼠背根神经节HCN1表达(P<0.01,见图3)。

**：与control组相比，P<0.01；## ：与STZ组相比，P<0.01。图3 各组大鼠背根节HCN1通道表达的变化

2.3.2 背根节HCN2通道表达变化与对照组比较，糖尿病周围神经痛大鼠在注射STZ后第3、 4周背根神经节HCN2表达升高(P<0.01,见图4)，鞘内给予ZD7288可显著降低糖尿病大鼠背根节HCN2通道的表达(P<0.01,见图4)。

**：与control组相比，P<0.01；##：与STZ组相比，P<0.01。图4 各组大鼠背根节HCN2通道表达的变化

3 讨论

链脲佐菌素(STZ) 为目前广泛采用的Ⅰ型糖尿病动物模型化学诱导剂。以往研究表明，注射STZ的第2周即可出现痛阈值的降低，痛敏可维持至第4周，随着时间的推移，到注射STZ后的第6周，大鼠逐渐出现痛觉减退，同时约38%的真皮内神经纤维丢失，故一般认为， STZ注射后的前4周属于糖尿病周围神经病变的早期阶段[8-10]。因此，我们选择在注射STZ第2周大鼠出现热痛敏后鞘内给药，观察STZ注射3、4周后的痛阈值和HCN1、HCN2通道表达变化。

背根节神经元兴奋性增高是产生病理性疼痛的关键，HCN通道富集于背根节神经元，尤其是HCN2主要表达于感受伤害性刺激的小型神经元。以往研究显示，背根节HCN2通道在病理性疼痛的产生中发挥关键作用：在外周炎性痛[11-12]和外周神经损伤所致的神经痛模型[13-15]，背根节神经元HCN2通道表达显著增加，Ih幅度增大，受损的神经纤维放电频率增高；全身或局部给予HCN通道抑制剂可降低Ih幅度及受损神经的异常放电，并显著减轻机械痛和/或热痛敏；此外，Emery等[16]发现，敲除背根节HCN2基因完全消除了足底注射福尔马林或角叉菜胶诱发的热痛敏、坐骨神经损伤导致的热/机械痛敏。这些研究均表明， HCN2激活导致的初级感觉神经元兴奋性增加促进了病理性疼痛的发生。另有研究显示背根节HCN1通道也参与病理性疼痛的发生：Momin等[17]发现，敲除背根节HCN1基因可明显减轻小鼠部分坐骨神经结扎诱发的冷痛敏；长期使用奥沙利铂(抗肿瘤药)诱发的神经痛大鼠背根节HCN1表达增加，给予选择性HCN1抑制剂MEL57A可明显缓解奥沙利铂诱发的神经痛[18]。最近，Sun等[19]发现，蜂毒诱发的炎性痛大鼠背根节神经元HCN1、HCN2表达增加、Ih增大，神经元兴奋性增高；给予ZD7288可降低背根节神经元Ih幅值及兴奋性，并缓解蜂毒导致的疼痛。以上研究均表明：HCN1,2激活导致的背根节神经元兴奋性增加促进了病理性疼痛的发生、发展。本实验STZ诱导的糖尿病大鼠在产生周围神经痛的同时，背根节HCN1,2通道表达显著升高，鞘内给予HCN通道拮抗剂ZD7288降低背根节HCN1,2表达的同时，明显缓解了周围神经痛，说明背根节HCN1,2通道表达的增加可促进糖尿病周围神经痛的发生与发展。由于ZD7288缺乏亚型针对性，尚无法确定HCN1、HCN2在糖尿病周围神经痛中的具体作用。此外，本实验鞘内给予ZD7288抑制HCN通道活化后，背根节HCN1，HCN2蛋白表达下降，这提示HCN通道活化增强神经元兴奋性的同时，可能影响胞内转录因子的活性，造成HCN1,2蛋白表达变化。Liu等[20]的研究也显示HCN通道拮抗剂可抑制奥沙利铂诱发的神经痛及脊髓背角Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶II/环磷腺苷效应元件结合蛋白(CaMKII/CREB)信号通路的过度活化。本实验ZD7288是否通过抑制CaMKII/CREB信号通路进而抑制背根节HCN1、HCN2的表达，有待进一步阐明。

关于糖尿病大鼠背根节HCN1,2通道活化的具体机制有待进一步阐明。以往研究显示，cAMP/PKA信号过度激活促进了慢性疼痛的产生与维持。近期研究发现，cAMP/PKA也是调节HCN通道功能的重要因子，胞内cAMP水平升高可加快HCN通道激活开放，Ih增强[21]。最近，Herrmann 等[22]发现，cAMP通过PKA激活背根节伤害性感觉神经元HCN2通道可促进炎性痛的产生。本实验STZ诱导的Ⅰ型糖尿病大鼠背根节HCN1,2通道激活是否由cAMP-PKA信号过度活化导致，有待进一步研究。

此外，我们的实验结果显示，尽管鞘内给予HCN通道拮抗剂ZD7288对糖尿病大鼠的周围神经痛可发挥良好的镇痛效应，但对血糖无明显改善作用，说明ZD7288的镇痛效应与血糖无明显关联。