电针通过mTOR1自噬途径调节改善胰岛素抵抗认知障碍大鼠的学习记忆功能

张 萌,杨鸿静,吴 松,王静芝

(湖北中医药大学,湖北 武汉 420061)

认知功能障碍的范围可以从严重损伤(痴呆)到不太严重的损伤(轻度认知障碍MCI),或更微妙的功能障碍形式[1]。其标志性神经病理基础是β-淀粉样蛋白(Aβ)斑块和细胞内tau神经原纤维缠结(NFT)[2]。研究发现哺乳动物脑胰岛素与海马功能密切相关[3],且胰岛素抵抗与Aβ斑块的产生增加和tau蛋白的过度磷酸化有关[4-5]。由胰岛素抵抗引起的认知功能障碍人数在痴呆全球总人数中占比达到了8%至20%[6]。近年来,电针改善胰岛素抵抗大鼠的大脑记忆功能疗效显著[7-8]。目前针灸干预认知障碍的靶点大致分为调节异常蛋白的水平(降低β淀粉样蛋白沉积、抑制Tau蛋白过度磷酸化)、调节中枢胆碱能系统、保护神经元(调节氧化应激、抑制细胞凋亡、改善神经元突触可塑性及上调神经营养因子的表达)、调节能量代谢(调节糖代谢、改善线粒体形态结构)和抑制炎性反应与上调自噬活性水平等[9]。mTOR1作为自噬信号通路参与了细胞的生长[10]。本研究选用胰岛素抵抗认知障碍大鼠模型,从mTOR1途径探讨电针干预对于认知障碍的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

于湖北省实验动物研究中心购入45只清洁级雄性Wistar大鼠,8周龄,体质量160～200 g,实验动物[许可证号:SCXK(鄂)2020-0018]。饲养于湖北中医药大学实验动物中心(温度18～25 ℃,湿度45%～55%),12 h/12 h昼夜循环光照,空气流通,大鼠自由摄食、饮水,饲养笼具及饮水瓶定期消毒。实验过程中对动物的处置严格遵照科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。适应性喂养3 d后采用随机数字表法进行分组,45只大鼠按1～45编号,从随机数字表中任一行任一列开始,读取3位数,并依次向后读取对应45只大鼠,随后按大小排序随机数,前1～10位为正常组进行普通饲料喂养,11～45位给予高脂饲料喂养8周,当模型大鼠IRI与正常大鼠相比明显升高时(P<0.01)[11],胰岛素抵抗模型造模成功,采用Morris水迷宫实验对高脂饲料喂养的大鼠喂养前以及喂养结束后进行行为学检测,以喂养前大鼠的平均逃避潜伏期作为参考值,当大鼠平均逃避潜伏期前后差值>参考值20%为造模成功,随后剔除不合格认知功能损害模型,其余30只胰岛素抵抗认知障碍大鼠随机分为模型组(10只)、假电针组(10只)和电针组(10只)。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 试剂 高脂饲料(上海斯莱克实验动物有限责任公司);小鼠单抗β-actin(42 KD)(武汉博士德生物工程有限公司,BM 0627);鼠多抗β-amyloid1-42(4.4 KD)(Bioss,Bs-0107 m);兔多抗p-Tau(79 KD)和兔多抗Tau(79 KD)、兔多抗wipi2(49 KD)(Affinity,Af 3148、Af 6141、Af 2734);兔单抗S100b(11 KD)、兔单抗mTOR(289 KD)和兔单抗atg13(70 KD)(Abcam,Ab 52642 、Ab 32028及Ab 201467);兔多抗Beclin1(52 KD)(武汉三鹰生物技术有限公司,11306-1-ap);HRP标记羊抗小鼠二抗、HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司,BA1051、BA1054);磷酸酶抑制剂、RIPA裂解液及BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天,S 1873、P0013 B及P 0010);PMSF(阿拉丁,P 105539);TEMED(国药集团化学试剂有限公司,80125336); HCl(信阳市化学试剂厂,GB 622-89);无水乙醇,二甲苯、盐酸、包埋石蜡及中性树胶(国药集团,10009218、10023418、10011018、69019361及10004160);苏木素(Sigma,H9627)。

1.2.2 仪器 酶标仪(Thermo,mμLISKANMK 3);离心机( 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司,H 1650);pH计 (德国Metter-Toledo GmbH公司,LP 115);微量移液器(Eppendorf);电转仪(北京六一仪器厂,DYY-7C、DYCZ-24DN及DYCZ-40);水平摇床(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司,TS-1);电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司,CPA);BandScan分析软件;中研太和牌针灸针(0.30 mm×25 mm,长春爱康医疗器械有限公司);华佗牌电针治疗仪(HANS-100 A型,苏州医疗用品有限公司);血糖仪(590血糖仪,江苏鱼跃医疗设备股份有限公司);脱水机(武汉俊杰JT-12J);病理切片机(德国Leica RM 2016轮转式);切片刀(日本羽毛R35);组织摊烤片机(武汉俊杰JK-6);载玻片及盖玻片(江苏世泰实验器材有限公司);抗原修复用电陶炉(SKG);显微镜(奥林巴斯BX53型)。

1.3 胰岛素抵抗大鼠模型的建立

适应性喂养3 d后随机选取10只进行普通饲料喂养,并将此组命为正常组,其余35只给予高脂饲料(5.4 kcal/g,含38.5%碳水化合物,15%蛋白质,46.5%脂肪)[12]喂养8周,8周后大鼠尾静脉采血,血糖仪检测FPG,Elisa法检测FINS,计算IRI=[FPG(mmol/L)×FINS(mIU/L)]/22.5,当模型大鼠IRI与正常大鼠相比明显升高时(P<0.01),胰岛素抵抗模型造模成功,采用Morris水迷宫实验对高脂饲料喂养的大鼠喂养前以及喂养结束后进行行为学检测,以喂养前的大鼠的平均逃避潜伏期作为参考值,当大鼠平均逃避潜伏期前后差值>参考值20%为造模成功,随后剔除不合格认知功能损害模型,其余30只胰岛素抵抗认知障碍大鼠随机分为模型组(10只)、假电针组(10只)和电针组(10只)。

1.4 干预方法

1.4.1 电针组 以标本配穴电针方法选取“百会”“足三里(后)”“中脘”“关元”“丰隆”5穴针刺,选用0.30 mm×25 mm不锈钢毫针,选穴参考2版《实验针灸学》教材[13]。“足三里(后)”和 “丰隆穴”直刺3～5 mm,“关元穴”向剑突方向、“中脘穴”向耻骨联合斜刺3～5 mm,采用电针治疗仪(HANS-100 A型)通电10 min,2 Hz疏波,强度为1 mA,同侧“足三里穴”“丰隆穴”连接同一输出的电极,“关元穴”“中脘穴”连接另一输出的电极,“百会穴”向后方平刺2～5 mm,不接电针,每周治疗3次,总疗程为8周。

1.4.2 假电针组 选穴同电针组,针刺连接电针后不进行通电,模型组与正常组不做其他处理。

1.5 取材

Morris水迷宫实验检测结束后,依组别脱颈处死,冰上剥取下丘脑,部分下丘脑组织按操作进行研磨,用于Western blot实验;部分下丘脑组织进行免疫组织化学实验。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 ELISA法检测大鼠FINS、计算IRI 8周喂养造模结束后,对4组大鼠进行禁食12 h,12 h后尾端静脉采血,离心取上清液。按照ELISA试剂盒说明书操作,使用酶标仪在450 nm波长测量各孔的吸光度(OD)值,测量后按照标准品OD值绘制标准曲线,并拟合标准方程,最后代入测定孔OD值,计算各孔FINS的含量。

随后血糖仪测量FPG,根据公式计算IRI。

1.6.2 Morris水迷宫实验 干预结束后1天检测大鼠认知功能。定位航行实验:大鼠放入水池自由游泳1 min进行适应性训练,在其适应水迷宫整体环境后,开始实验,平台置于第4象限,低于水面1 cm,在4个象限入水点处依次将大鼠面向池壁投入水中,同一只老鼠放入4个象限的间隔时间为5 min, 记录其规定时间内(60 s)寻找到平台的时间,此时间记录为该大鼠的逃避潜伏期,若超过60 s未找到平台,引导其登陆平台,逃避潜伏期计为60 s,连续5 d。

空间探索实验:定位航行实验结束次日撤除迷宫内平台,大鼠从平台象限外3个象限入水点分别随机面向池壁入水,记录其在60 s内跨越原平台位置的次数及时间。

1.6.3 Western blot检测大鼠下丘脑组织Aβ1-42、p-Tau、S100b、mTOR、WIPI2、Atg13及Beclin1蛋白表达水平 大鼠处死后取下丘脑组织加入蛋白裂解液,匀浆,离心5 min,-20 ℃保存上清液,用BCA蛋白浓度测定试剂盒按步骤测蛋白浓度,将提取的蛋白上清液沸水浴5 min使蛋白充分变性。随后跑电泳加转膜,用含5%脱脂奶粉的TBST(封闭液)浸泡PVDF膜封闭2 h,加入一抗Aβ1-42、一抗β-actin、一抗p-Tau、一抗S100b、一抗mTOR、一抗WIPI2、一抗Atg13及一抗Beclin1(分别1∶400、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000及1∶1 000稀释),4 ℃孵育过夜,洗膜5次,5 min/次,加入二抗(1∶10 000稀释),室温摇床孵育2 h,洗膜同上述,X线胶片成像扫描后,用BandScan分析胶片灰度值。

1.6.4 免疫组化检测大鼠下丘脑神经元 大鼠脱颈处死后,取出下丘脑组织用多聚甲醛(4%)固定,随后自动脱水机中脱水,再进行浸蜡及组织包埋,切片,厚度4 μm,随后经脱蜡、抗原修复,滴加一抗(Aβ1-421∶100,p-tau 1∶100)、二抗,镜下观察并完成镜检拍照。使用Image-Plus6.0软件对免疫组化照片进行光密度分析,每张切片选取5张400倍组化照片做光密度分析,求均值。

1.7 统计学处理

2 结果

本实验过程中有5只大鼠未通过认知功能损害模型筛查,予以剔除。

2.1 治疗结束后各组大鼠FINS、FPG及IRI比较

相较于正常组,其他3组大鼠的FINS、FPG及IRI显著提高,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组、假电针组比较,电针组大鼠FIN、FPG及IRI出现了不同程度的降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠治疗结束后FPG、FINS及IRI比较

2.2 各组大鼠治疗后记忆能力、行为学的比较

与正常组比较,模型组大鼠第1天就出现了平均逃避潜伏期延长,差异具有统计学意义(P<0.01),目标象限探索时间缩短,差异具有统计学意义(P<0.01),穿越平台次数减少,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,假电针组平均逃避潜伏期从第4天出现了减少,差异具有统计学意义(P<0.05);电针组大鼠平均逃避潜伏期从第2天开始显著减少,差异具有统计学意义(P<0.01),目标象限探索时间增加,差异具有统计学意义(P<0.01),穿越平台次数增加,差异具有统计学意义(P<0.01);与假电针组比较,电针组大鼠平均逃避潜伏期从第4天开始显著减少,差异具有统计学意义(P<0.05),目标象限探索时间增加,差异具有统计学意义(P<0.01),穿越平台次数增加,差异具有统计学意义(P<0.01)。见图1、表2～3。

图1 各组大鼠治疗结束后逃避潜伏期比较

表2 各组大鼠治疗结束后逃避潜伏期比较

表3 各组大鼠治疗结束后目标象限探索时间与穿越平台次数比较

2.3 各组大鼠下丘脑Aβ1-42、p-Tau及S100b蛋白表达变化

结果显示,模型组的Aβ1-42、p-Tau及S100b蛋白相对表达量显著高于正常组,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组、假电针组比较,电针组的Aβ1-42、p-Tau及S100b蛋白表达水平出现了不同程度的降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。见图2、表4。

图2 各组大鼠治疗结束后Aβ1-42、p-Tau及S100b蛋白表达

表4 各组大鼠治疗结束后Aβ1-42、p-Tau及S100b蛋白表达比较

2.4 各组大鼠免疫组织化学结构与Aβ1-42、p-Tau平均光密度的变化

如图3所示,棕黄色或棕褐色细胞膜是各组大鼠下丘脑 Aβ1-42、p-Tau 的阳性表达(箭头所示),治疗结束后,相较于正常组,模型组大鼠Aβ1-42、p-Tau的阳性表达明显增多,平均光密度明显增高,差异具有统计学意义 (P<0.01);相较于模型组,假电针组与电针组Aβ1-42、p-Tau的阳性表达出现不同程度减少,平均光密度明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01);相较于假电针组,电针组Aβ1-42、p-Tau 的阳性表达出现不同程度减少,平均光密度明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见图3、表5。

图3 免疫组织化学与Aβ1-42、p-Tau平均光密度(400×)

表5 免疫组织化学检测Aβ1-42、p-Tau平均光密度

2.5 各组大鼠mTOR1、Beclin1、WIPI2与Atg13蛋白表达变化

治疗结束后,相较于正常组,模型组的mTOR1蛋白表达水平显著增加,差异具有统计学意义(P<0.01),Beclin1、WIPI2与Atg13蛋白表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.01);相较于模型组,电针组的mTOR1的蛋白表达量降低,差异具有统计学意义(P<0.01),Beclin1、WIPI2及Atg13蛋白表达水平出现了不同程度的增加,差异具有统计学意义(P<0.01);相较于假电针组,电针组的mTOR1的蛋白表达量降低,差异具有统计学意义(P<0.05),Beclin1、WIPI2与Atg13蛋白表达水平出现了不同程度的增加,差异具有统计学意义(P<0.01)。见图4、表6。

图4 各组大鼠治疗结束后mTORC1、Beclin1、WIPI2与Atg13蛋白表达

表6 各组大鼠治疗结束后mTORC1、Beclin1、WIPI2与Atg13蛋白表达比较

3 讨论

研究发现随着2型糖尿病患者患病时间的加长,认知障碍共同发生的风险会增加一倍[14-15]。中医学中并未出现对“认知障碍”这一病名的记载,现代医学CI属于中医“呆病”范畴,包括“喜忘”健忘”“善忘”等神志病范畴。《黄帝内经》首载“善忘”“喜忘”。胰岛素抵抗,古可谓之“消渴”,消渴症者,五脏皆虚,遂生痰浊[16]。百会位于巅顶,具有醒脑开窍功效,脑部疾病当取百会,以补脑醒神改善认知功能,研究也表明针刺百会穴可有效发挥其对神经的保护作用[17];足三里为胃之下合穴,为强壮后天胃气之要穴,针刺足三里可以改善大鼠认知障碍[18],中脘可调节胃部气血,关元固护一身之元气,丰隆化痰祛湿以更进一步改善胰岛素抵抗,又以足三里配丰隆,可有效改善胰岛素抵抗[19]。基于以上,结合“标本配穴”法,选取局部(头颈部)腧穴百会与远端辨证取穴相结合。以足三里、关元固护脾肾先后天之本,配以丰隆化痰祛湿,胃局部穴位中脘以利导邪气排除[20],补肾健脾胃,以达标本兼治效果。

认知障碍的主要病理改变为淀粉样蛋白沉淀与神经原纤维缠结,其分别由淀粉样前体蛋白(APP)的淀粉样β蛋白(Aβ)斑块与成对螺旋细丝(PHF)的磷酸化tau蛋白形成[21-23]。相关研究发现,胰岛素抵抗认知障碍大鼠的认知损伤主要是注意力、视觉结构、学习功能和言语记忆等方面[24]。高脂饮食动物模型诱导的认知障碍模型大鼠的胰岛素降解酶(IDE)的下调导致了Aβ的清除减少,并在这其中观察到了Tau的磷酸化[25]。S100b蛋白是钙粒蛋白的主要成员,分布在胞浆与胞核内,主要由星形胶质细胞分泌,S100b同时调节细胞内外活性,细胞外 S100b主要通过参与晚期糖基化终产物受体(RAGE)一直参与阿尔茨海默病的病理生理神经炎症[26]。当S100b蛋白浓度上升到微摩尔水平时,蛋白表现出神经毒性诱导促炎因子释放加重AD患者炎症,同时过度表达的S100b蛋白还可通过钙依赖途径使神经元凋亡,促使神经系统退行性变[27]。

自噬是一种细胞内降解过程,被称为细胞“清道夫”,其与神经退行性疾病的生理病理过程中密不可分[28]。研究表明,自噬可以清除Aβ积累,减轻Aβ毒性,也可以介导tau蛋白聚合物的降解[29-30]。在哺乳动物细胞自噬过程中,ULK1(unc-5-like kinase 1)复合物是细胞自噬起始的第1个特异性复合物,其由ULK1、Atg13,FIP200(focal adhesion kinase family inte-racting protein of 200 kDa)和Atg101组成;随后,ULK1复合物下游的主要效应分子复合物之一VPS34(va-cuolar protein sorting 34)复合物1催化生成PI3P(phosphatidylinositol 3-phosphate)在自噬前体的延伸中发挥作用,VPS34复合物1由VPS34(Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶)、Beclin1、VPS15和 ATG14L (类 ATG14)等核心组成;在自噬前体延伸过程中,PI3P直接招募WIPI2蛋白,促进LC3(microtubule-associated protein 1 light chain 3)家族蛋白的脂质化修饰,影响自噬[31-32]。mTORC1信号通路参与自噬调节,在激活自噬中具有门控作用,激活的mTORC1直接磷酸化ULK1,从而抑制细胞自噬的起始[31]。研究表明,mTORC1可以磷酸化Atg13的Ser258 点位,抑制ULK1 的激酶活性从而影响自噬[33]。又ULK1可以直接磷酸化 Ser14处的 Beclin1,增强VPS34活性从而进一步启动自噬[34]。同时在基底细胞条件下[35-36],mTORC1的活性影响着WIPI2的表达,在自噬诱导过程中,当mTORC1失活时,WIPI2以稳定的去磷酸化形式存在,对细胞中mTORC1的生理或药理抑制可以促进WIPI2的稳定、自噬体的形成和自噬降解[37]。所以,mTORC1、Atg13、Beclin1与WIPI2的蛋白含量可以在一定程度上反映哺乳动物的自噬强度。本研究结果显示,相对于正常组,模型组大鼠的mTORC1蛋白含量增加,Beclin1、Atg13及WIPI2蛋白含量降低,电针组mTORC1蛋白相对表达相较于模型组显著减少、Beclin1、Atg13及WIPI2蛋白相对表达增加,提示电针可以有效的影响大鼠细胞自噬,可能与下调mTORC1信号通路有关。

本实验以高脂饮食造模,通过电针干预观察结果,结果显示,相较于模型组与假电针组,电针干预可以有效降低大鼠海马区的Aβ1-42、p-Tau及S100b蛋白相对表达量,下丘脑区Aβ1-42与p-Tau阳性表达降低,这与水迷宫实验中电针组大鼠逃避潜伏期显著缩短、穿越平台次数增加的结果相一致。与此同时电针组mTORC1蛋白相对表达相较于模型组显著减少,Beclin1、Atg13及WIPI2蛋白相对表达增加,说明在胰岛素抵抗认知障碍过程中,电针可以有效提高自噬活性,电针对于胰岛素抵抗认知障碍大鼠的防治效应有可能通过mTOR1信号通路实现。电针改善胰岛素抵抗认知障碍的作用机制是多靶点、多通道的,今后需要发现设计更多的靶点、更加精准的实验方案,以期更准确全面地探究电针改善胰岛素抵抗认知障碍大鼠的作用机制。