电针天枢、上巨虚对肠易激综合征大鼠模型结肠功能的影响

刘婷婷,陈少宗,赵香顺,石运来,于燕南,杨添淞

(1.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040;2.山东中医药大学针灸研究院,山东 济南 250355;3.山东中医药大学,山东 济南 250355;4.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040;5.黑龙江省中医药信息学重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150040)

肠易激综合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是临床常见慢性消化系统疾病,发病病因可能与肠动力异常、内脏感知异常及精神心理刺激等有关。IBS发病率呈逐年上升趋势且病程缠绵难愈,影响患者日常生活质量[1],目前现代医学根据主要症状进行药物干预治疗,但治疗效果不佳[2-3];越来越多研究以及Meta分析结果证实,针灸治疗IBS具有优势,即可调节因胃肠道运动功能紊乱引起的便秘、腹泻等症状,又可以缓解或降低因内脏敏感引发的腹部不适等症状,相较于常规药物治疗效果更加显著且复发率较低[4-6],根据课题组前期经验,本研究运用急慢性应激联合方法制备IBS动物模型,观察电针“天枢”“上巨虚”对IBS模型大鼠结肠功能(感觉、运动)的影响,探讨电针治疗IBS可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及分组 选用体质量(200±20)g的雄性清洁级Wistar大鼠,由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供[许可证号:SCXK(鲁)2019-0003]。所有大鼠于清洁级实验室中饲养,保持室内安静,室内温度为(22±2)℃,室内相对湿度为35%～40%,12/12 h昼夜节律循环,黑夜时间水和食物均可自由摄取。在研究进行前,大鼠在标准实验环境中适应性饲养7 d,不予任何刺激。

1.1.2 主要实验器材 针灸针(苏州医疗用品厂有限公司);电针仪(苏州医疗用品厂有限公司);一次性无菌注射器(山东威高集团医用高分子制品股份有限公司);冷冻型高通量组织研磨器(宁波新芝生物科技股份有限公司);高速离心机(山东奥恒生物科技有限公司);电热恒温培养箱(北京开源国创科技有限公司);全自动酶标仪(赛默飞世尔科技公司);化学发光成像系统(VILBER LOURMAT,Fusion solos S);旋涡混合器(北京开源国创科技有限公司);恒温金属浴(上海一恒科技有限公司);电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

1.1.3 主要实验试剂 甘油(上海北诺生物科技有限公司,#1280ML100);生理盐水(辰欣药业股份有限公司,国药准字H37022337);BCA蛋白浓度测定试剂盒、转膜缓冲液、抗体稀释液和超敏ECL显影液(山东思科捷生物技术有限公司,#EC0001、#ED0001、#ED0014及#ED0015);蛋白预制胶(南京艾思易生物科技有限公司,#F00001GelS);预染蛋白Marker(美国Thermofisher公司,#26616);兔抗GAPDH单克隆(美国Proteintech公司,#10494-1-AP);兔抗NK-1R单克隆抗体(美国SAB公司,#41243);HRP-山羊抗兔IgG(H+L)抗体(美国Proteintech公司,#SA00001-2);大鼠SP ELISA试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司,#JYM0328)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备 实验按照随机原则,将大鼠分为空白组和造模组,造模组大鼠采用慢性应激和急性应激联合法制备IBS模型。参照文献方法[7-8],将大鼠暴露不同的压力源:①慢性避水应激1 h;②断食24 h;③断水24 h;④昼夜颠倒12 h;⑤冰水游泳5 min;⑥鼠笼45°倾斜;⑦夹尾5 min。慢性避水应激方法于每日上午进行,下午随机使用其他任何应激方法,连续干预造模10 d。

1.2.2 模型评价 造模10 d结束后,对造模组大鼠结直肠扩张(Colorectal distention,CRD)时进行腹壁撤回反射(Abdominal withdrawal reflex,AWR)半定量的评分[9-10],为了减少大鼠粪便形成,实验开始前对所有大鼠禁食不禁水18 h。用自制的球囊(长9 cm、宽3 cm)于石蜡润滑之后经导管缓慢插入直肠,深度大约6～7 cm。把大鼠放到一个透明并内部空间相对狭窄的观察箱,导管另一端用三通管分别连接血压计和30 mL医用注射器,待大鼠在透明箱内适应并平静之后,通过注射器缓慢向气囊注入空气,血压计显示40 mmHg,间隔5 min后给下一次刺激;每次刺激强度重复3次,取平均值作为最后的评分。在整个操作过程中保证自制球囊无破损、不漏气,操作人员固定,确保大鼠AWR评分的相对客观性和统一性。

每天记录大鼠在1 h的慢性避水应激后大便颗粒数,与空白组比较,AWR半定量评分≥3分以及造模组大鼠大便颗粒数具有统计学意义,即判定大鼠造模成功。

1.2.3 分组与干预 继AWR评分后,将造模组确定制备成功的大鼠随机分为模型组和电针组(天枢组、上巨虚组),每组各10只,分组后对大鼠进行电针治疗。穴位定位参考华兴邦等制定的《大鼠穴位图谱的研制》[11]以及郭义等主编的《实验针灸学实验指导》[12]中大鼠标准穴位图谱,参照人体经穴定位取“天枢”和“上巨虚”。将电针组大鼠进行抓取、捆绑,选用0.25 mm×13 mm毫针对大鼠双侧天枢和上巨虚进行针刺,进针深度分别为3 mm和5 mm,接上电针治疗仪,电针参数设置为频率2 Hz、强度1 mA的连续波,1次/d,20 min/次,针刺14 d。空白组大鼠正常喂养,不做任何处理,模型组大鼠仅每天与电针组大鼠使用相同方法进行抓取、捆绑,但不给予电针干预。

1.2.4 观察指标 ①结直肠痛敏测定:实验开始前,为了减少粪便的形成,对各组大鼠禁食不禁水24 h。大鼠腹腔注射4%水合氯醛进行麻醉,大鼠麻醉后将其取仰卧位,处理大鼠腹部皮毛,沿大鼠腹正中线与髂前上棘连线处进行常规消毒,剪开皮肤并剥离开皮下脂肪,暴露腹直肌。借用1.5 mL针头使两根电极丝植入到距腹正中线1.5 cm处。再将石蜡润滑后的自制气囊经大鼠肛门插入6～7 cm处,用医用胶带把大鼠尾巴根部和导管缠在一起以防滑脱。给气囊缓慢注气后,通过置于腹直肌的两根电极引出肌电信号。运用Powerlab数据采集分析系统,观察并记录各组大鼠腹直肌放电活动。②血清测定:待大鼠腹外斜肌放电测定后,迅速剪开大鼠胸腔完全暴露心脏及主动脉。先借用无菌针管抽取3 mL大鼠右心耳血液,室温静置30 min后进行离心,取上清快速移至-80 ℃冰箱保存。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清SP含量,具体步骤参考试剂盒操作说明。③结肠NK-1R受体表达测定:待大鼠取血在室温静置过程中,迅速进行常规生理盐水灌注,每只大鼠灌注200～300 mL生理盐水,直至大鼠四肢发白。在冰上快速取出结肠,冲洗干净肠容物,快速置入EP管并移至-80 ℃冰箱中保存备用。采用免疫蛋白印迹(Western blot)法检测各组样本的蛋白表达,每组大鼠随机分别抽取4个样本,提取总蛋白,充分剪碎组织后,低温高通量组织研磨器研磨,冰浴30 min,然后4 ℃离心。BCA法测定蛋白浓度,取30 μg蛋白上样量,按上样蛋白体积与5×上样缓冲液4∶1的比例混合,金属浴100 ℃,煮10 min蛋白变性。将各组蛋白上样,电泳60 min,转膜70 min,5%奶粉封闭2 h,TBST清洗3次×10 min,孵育一抗,室温30 min,4 ℃过夜;TBST清洗3次×10 min,孵育二抗,室温1.5 h,TBST清洗3次×10 min。运用凝胶成像系统自动曝光显影。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 电针对各组大鼠结直肠痛敏的影响

与空白组比较,模型组大鼠的结肠疼痛阈值显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01);电针干预治疗结束后与模型组比较,电针天枢组以及上巨虚组大鼠结肠疼痛阈值均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠疼痛阈值的测定

2.2 电针对各组大鼠血清P物质的影响

与空白组大鼠比较,IBS模型组大鼠血清SP含量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),电针干预治疗后,电针天枢组以及上巨虚组血清SP均明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠血清SP和NK-1R蛋白表达量的测定

2.3 电针对各组大鼠结肠蛋白表达的影响

对大鼠近端结肠NK-1R蛋白检测显示,与空白组比较,模型组大鼠的蛋白表达升高,差异具有统计学意义(P<0.05);干预治疗后与模型组比较,电针天枢组以及上巨虚组蛋白表达均降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1、表2。

图1 各组大鼠结肠中NK-1R受体蛋白免疫印迹图

3 讨论

肠易激综合征是临床常见慢性胃肠道功能紊乱疾病,临床表现主要是肠道运动功能异常和内脏高敏感性两方面症状改变[13-14],目前临床和基础研究普遍把内脏高敏感和肠道运动功能紊乱看做病理生理学基础[15]。结肠高敏感性主要以腹胀、腹痛等为主要症状表现;结肠运动功能紊乱由结肠平滑肌收缩异常导致排便习惯和大便性状改变等为主要症状表现。本研究采用慢性应激和急性应激联合法制备IBS模型,从躯体和精神两方面对大鼠进行双重刺激,增强IBS大鼠模型的持续性和稳定性,更贴近IBS患者的临床症状。

P物质广泛分布在中枢神经系统和消化系统[16],通过与SP高亲和力受体(SPR)结合对靶细胞发挥生物效应从而调节胃肠功能[17]。在胃肠道中,SP受体包括神经激肽1型受体(NK-1R)、神经激肽2型受体(NK-2R)和神经激肽3型受体(NK-3R)。SP通过NK-1R、NK-3R受体对胃肠平滑肌细胞靶细胞发挥生物效应,调节胃肠道感受功能、平滑肌的肌肉运动,促进平滑肌收缩,加速胃肠蠕动[18-19]。Lu等[20]研究表明,慢性避水应激方法制备IBS大鼠模型血清SP含量升高;姚永刚等[21]研究结果显示,与正常组相比IBS大鼠模型结肠SP-NK1R受体mRNA的表达明显增加,免疫组化结果显示NK-1R受体在结肠黏膜层以及肌层的分布区呈显著浓染。本实验结果显示,与正常组大鼠相比,模型组大鼠结肠痛敏阈值降低(P<0.01),血清SP含量升高(P<0.05),结肠SP-NK1R受体蛋白表达升高(P<0.05),研究结果表明血清SP含量和结肠中SP-NK1R受体蛋白表达异常会影响IBS模型大鼠结肠功能,并且电针天枢、上巨虚可降低IBS模型大鼠结肠痛敏阈值以及调节结肠运动功能异常。

目前,现代医学对IBS的治疗尚无特效疗法,越来越多实验证实针灸在IBS内脏痛的干预治疗有显著的疗效,主要通过刺激经络以及各种神经组织,激发机体镇痛系统从而达到镇痛效果[22-24]。中医学根据临床表现症状将IBS归属于“泄泻”“便秘”“腹痛”等范畴,《灵枢·邪气藏府病形》记载:“飧泄,大肠痛,巨虚上廉主之”;《针灸大全》记载:“腹中寒痛,泄泻不止,里急后重,天枢二穴”。从神经解剖学角度分析,胃肠道平滑肌活动是接受交感神经(T9～12)和副交感神经(S2～4)的双重支配[25-27],天枢穴的躯体传入信号主要投射到T9～11[28],上巨虚神经支配主要来源于L4～S1神经节段[25],天枢穴和上巨虚穴的神经支配与胃肠道的神经支配在脊髓水平高度重叠,刺激天枢和上巨虚穴可将信号直接投射于大肠的神经节段分布区。秦庆广等[29]研究显示,上巨虚为集元穴,针刺集元穴信息通过神经通路到达脊髓中枢,激活用来支配空肠和远端结肠的副交感神经系统,进而刺激空肠和远端结肠运动[30-32],针刺天枢通过增强交感神经兴奋水平,以此激活肾上腺素能β1/2受体,进而对结肠运动产生效应[33-34]。因此,传统中医理论和神经生物学理论都能表明针灸天枢和上巨虚治疗IBS的科学性和可靠性。

综上所述,电针天枢和上巨虚可通过降低血清SP含量以及远端结肠SP受体NK-1R蛋白表达,缓解IBS大鼠模型内脏敏感性,调节IBS大鼠结肠感觉和运动功能异常。