幼龄小鼠细菌性脑膜炎模型的建立#

冯梓琦 郑景文 王霞 万莉红△

（1. 明远学园——基础医学拔尖学生培养基地（怀德班）2019 级，四川大学华西基础医学与法医学院，四川 成都 610041；2. 四川大学华西基础医学与法医学院药理学教研室，四川 成都 610041；3. 四川大学华西第二医院检验科，四川 成都 610041）

细菌性脑膜炎（Bacterial meningitis，BM）是指因病原菌感染导致宿主硬脑膜、蛛网膜、软脑膜发生炎症的感染性疾病，是儿童中枢系统中最常见的感染性疾病。临床常见表现为发热、颈强直、癫痫发作、谵妄、嗜睡、昏迷等[1]。肺炎链球菌是最常见的致病菌之一[1-4]，在现有的预防治疗措施下，仍具有高致死致残率[2,3][5]。据研究，细菌性脑膜炎致死率在儿童感染性疾病中排行前十[2]，25-50%的幸存患者会出现严重的认识障碍、继发性脑水肿、神经组织形成坏死性病灶等神经系统后遗症[4]。细菌性脑膜炎的具体发病机制尚不清楚。目前认为病原菌可以直接侵犯或间接通过引起各类炎性因子的释放来破坏血脑屏障的完整性或改变其通透性，从而最终入侵中枢神经系统，引起严重的神经损害甚至死亡[5]。

现已有多种成年动物模型用于研究细菌性脑膜炎。例如，通过鼻腔滴注或腹腔注射菌悬液建立的血源性感染模型多用于研究致病机理和疫苗开发，但其造模成功率仅在50%左右[6,7]。为了更高效的建立动物模型，目前的普遍方法是将菌悬液直接注射入脑室系统，注射方式包括侧脑室注射（Intracerebroventricular injection，ICV）[8]和小脑延髓池注射[9]等。其中，侧脑室注射技术成熟、成功率高，是较为常用的造模方法。既往研究发现，哺乳期大鼠细菌性脑膜炎模型与成年模型相比具有特殊性，海马和皮质的损伤表现不同[10,11]。因此，为了更好的探究儿童细菌性脑膜炎的致病机理和诊疗靶点，建立幼龄小鼠模型十分重要，但目前尚无研究确定幼龄小鼠侧脑室注射坐标。本文拟通过侧脑室注射伊文思蓝确认4 周龄小鼠ICV 坐标，并以此为基础注射肺炎链球菌悬液初步评估脑膜炎模型建立情况，以期为后期研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及菌株

4 周龄SPF 级C57BL/6 雄性小鼠，购自成都达硕实验动物有限公司（中国，成都），饲养于独立送风隔离笼具中，光暗循环12:12，温度22°C、湿度55%。

肺炎链球菌D39 菌株（血清型2 型），由四川大学华西第二医院保种。

1.1.2 试剂

THB 培养基（海博生物，中国青岛），酵母提取物（北京索莱宝科技有限公司，中国北京），哥伦比亚血平板（环凯微生物科技有限公司，中国广东），PBS 缓冲液（武汉赛维尔生物科技有限公司，中国武汉）伊文思蓝染色液（北京索莱宝科技有限公司，中国北京），戊巴比妥钠（由机能实验室提供）。

1.2 方法

1.2.1 肺炎链球菌培养及悬液制备

肺炎链球菌D39 菌株培养于哥伦比亚血平板上，置于37°C、5% CO2培养箱中。挑取菌落接种于肉汤培养基中（含0.5%酵母提取物），置于恒温摇床中过夜(摇床温度37°C，振速260 r·min-1）。将1 体积的过夜培养基（5 mL）加入20 体积的新鲜肉汤中，并孵育至生长对数期，收菌。收菌后9000 rpm 低温离心4 min，PBS 重悬稀释，均匀涂开分布于血琼脂平板上，放入培养箱过夜。

制作菌悬液时用生理盐水润洗平板3 次，9000 rpm 低温离心4 min，弃去上清，获得菌体沉淀。生理盐水重悬，调整菌悬液浓度至1×109CFU·mL-1（OD600=1），后根据注射所需浓度进行稀释。

1.2.2 4 周龄小鼠右侧脑室注射

小鼠适应性喂养一周后，称重，腹腔注射给予戊巴比妥钠（50 mg·kg-1）麻醉。后将小鼠固定于立体定位仪（瑞沃德生命科技有限公司，中国广东）上，备皮，于两耳平齐位置沿中线剪开头顶皮肤。根据成年小鼠ICV 坐标（ML：-1.5 mm，AP：-0.6 mm，DV：-1.7 mm）及发育期小鼠脑成像[12]摸索4 周龄小鼠右侧脑室坐标。确定试验坐标后用颅骨钻钻孔，使用玻璃微针注射器（瑞沃德生命科技有限公司，中国广东）以0.5 μL·min-1的速度缓慢注射2 μL 伊文思蓝。留针观察15 min 后处死小鼠，剪开颅骨观察染液扩散分布。

1.2.3 4 周龄小鼠肺炎链球菌脑膜炎模型的构建

确认4 周龄小鼠注射坐标为ML：-1.3 mm，AP：-0.5 mm，DV：-1.6 mm，采用上述方法向小鼠右侧脑室注射2 μL 含3.5×105CFU 肺炎链球菌悬液，留针15 min 后缝合，术后复温。对照组注射等量生理盐水。

1.2.4 Loeffler 神经行为学评分

术后20 h 分别对模型组及对照组小鼠进行Loeffler 神经行为学评分：5 分-抓住背部时能正常运动，在5 秒内翻身；4 分-自主运动减少；3分-翻身＞5 s；2 分-不能翻身；1 分-不能运动；0 分-死亡。

1.2.4 病理评价

术后20 h 仍存活的动物，进行Loeffler 神经行为学评分后断颈处死。立即用无菌手术剪沿后囟剪开颅骨，取出脑组织置于4%多聚甲醛4°C 固定，石蜡包埋后切片，HE 染色。每张切片在100 倍镜下随机选取5 个视野观察软脑膜、蛛网膜结构形态及邻近皮层炎症细胞浸润情况。

1.3 统计学分析

所有数据通过GraphPad Prism 8.0 进行分析，计量资料以均数±标准差（±SD）表示，采用one-way ANOVA 方差分析检验，其中P＜0.05表示差异具有统计学差异。

2 结果

2.1 ICV 注射坐标

定位小鼠右侧脑室（中线右旁开1.3 mm，前囟后0.5 mm，垂直深度1.6 mm，即ML：-1.3 mm，AP：-0.5 mm，DV：-1.6 mm），以0.5 μL·min-1 的速度缓慢注射2 μL 伊文思蓝。如图1 所示，背面观注射创伤小，15 min 后染液由右侧脑室随脑脊液循环分布至双侧侧脑室、颅底窝等。

图1 经侧脑室向4 周龄小鼠注射伊文思蓝后头颅解剖示意图

2.2 4 周龄小鼠肺炎链球菌脑膜炎模型初步建立成功

以2 μL 生理盐水或等体积3.5×105CFU 肺炎链球菌悬液分别侧脑室注射，于20 h 后进行Loeffler 神经行为学评分。对照组小鼠进食饮水正常，活动良好；模型组有一只小鼠死亡，其余小鼠均出现不同程度的活动能力丧失，伴随呼吸明显加快和震颤。统计学结果显示模型组Loeffler 神经行为学评分明显低于对照组（P＜0.05），见表1。

表1 Loeffler 神经行为学评分评估造模效果（±SD，n=6）

表1 Loeffler 神经行为学评分评估造模效果（±SD，n=6）

注：与对照组相比，**P＜0.01。

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2.3 4 周龄小鼠肺炎链球菌脑膜炎模型的病理改变

镜下观察小鼠脑组织切片HE 染色结果，肺炎链球菌悬液感染20 h 后，模型组小鼠蛛网膜结构被破坏，软脑膜充血，出现明显的炎性细胞浸润；而对照组小鼠脑膜结构正常，见图2。

图2 HE 染色观察小鼠脑膜结构变化（100×）

3 讨论

细菌性脑膜炎是儿童高发的感染性疾病，现认为病原菌可直接或间接引起中枢损伤，造成严重脑功能障碍，甚至导致患儿死亡。过去的研究多使用成年动物疾病模型，但已知幼龄啮齿类脑膜炎动物模型的脑损伤具有特殊性[10,11]。故为了有针对性的探究儿童细菌性脑膜炎的致病机理，建立更高效稳定的幼龄动物模型十分必要。在小鼠中，侧脑室注射菌悬液是常用的肺炎链球菌脑膜炎模型的建立方法。但因幼龄小鼠仍处发育期，尚无研究给出详细的侧脑室注射坐标、造模方法及模型评价结果。

本研究使用4 周龄C57BL/6 雄性小鼠，以成年小鼠右侧脑室坐标及小鼠发育阶段脑成像为依据，定位注射伊文思蓝染液，后处死小鼠并剪去颅骨，从脑整体及矢状切面可观察到蓝色染液沿脑脊液循环分布至脑室系统、蛛网膜下腔等处。故确定该年龄段小鼠侧脑室注射的可行坐标为ML：-1.3 mm，AP：-0.5 mm，DV：-1.6 mm。除此之外，本研究使用的玻璃微针注射器造成的创伤较小，有效的提升了注射安全性和小鼠存活率，有助于模型的稳定建立。前人研究发现，血源性感染造模的成功率较低，直接向小鼠的侧脑室注射菌悬液可以同时提高造模成功率和模型动物生存率[8]。本文确定了4 周龄小鼠侧脑室定位后，进行了肺炎链球菌（D39 菌株）悬液ICV 造模。20 h 后观察，模型组小鼠出现明显的脑膜炎症状，包括呼吸急促、震颤、活动能力显著减弱甚至死亡。病理切片显示模型组小鼠出现明显的脑膜结构破坏及炎症浸润，故说明该模型基本建立成功。综上所述，本文确定了4 周龄C57BL/6 雄性小鼠右侧脑室注射坐标，可用于建立稳定高效的幼龄小鼠细菌性脑膜炎模型，有助于推进儿童细菌性脑膜炎相关基础研究。