层粘连蛋白γ1 基因沉默对膀胱癌细胞增殖及细胞周期的影响

李彬琦 李文明

1.河北省邯郸市中心医院综合科，河北邯郸 056001；2.河北省邯郸市中心医院院前急救，河北邯郸 056001

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，具有易复发、易转移的特点[1-2]。膀胱癌患者早期仅出现无痛性血尿，往往不够重视，延误病情，导致晚期膀胱癌患者治疗效果不够理想，严重影响患者生活质量[3-5]。因此，深入研究膀胱癌发生发展的具体分子机制对进一步提高膀胱癌的早期诊断和治疗具有重要的意义[6-8]。层粘连蛋白γ1（recombinant laminin gamma 1，LAMC1）作为细胞外基质的重要调节因子，在细胞的增殖、分化和黏附中发挥着重要的作用[9]。LAMC1 在肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭及转移等恶性生物学行为发挥重要作用[10-12]。但LAMC1 对膀胱癌细胞增殖、细胞周期的影响及其相关机制尚不清楚。本研究以膀胱癌细胞5637 作为研究对象，检测干扰LAMC1 基因表达后对膀胱癌细胞增殖和细胞周期的影响并探讨其潜在的相关机制，旨在探讨LAMC1 与膀胱癌细胞生物学特性的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究从河北省邯郸市中心医院采集了2019 年1 月至2021 年12 月的行根治膀胱全切术并经病理确诊的48 例膀胱癌患者的癌及癌旁组织，癌旁组织选择距癌灶边缘5 cm 以上并病理诊断为正常组织。其中包括男32 例，女16 例；＜60 岁14 例，≥60 岁34 例；平均年龄（66.3±14.2）岁；T2期26 例，T3～4期22 例。本研究经河北省邯郸市中心医院伦理委员会批准通过（20190124），并在采集标本前均获得患者知情同意并签署了知情同意书。

1.2 纳入及排除标准

纳入标准：①原发性肿瘤，且术后病理组织活检证实为膀胱癌；②有完整的临床、病理及预后随访资料。排除标准：①妊娠期及哺乳期的妇女；②合并其他恶性肿瘤；③肝、肾功能障碍；④合并自身免疫性疾病、血液系统疾病及其他器官或系统恶性肿瘤；⑤术前行放、化疗及免疫治疗。

1.3 材料

人膀胱癌UMUC3、T24、5637 及J82 细胞购于中国科学院上海生科院细胞库；RPMI-1640（SH30809。01）培养基和胎牛血清（货号：SV30087.03）购于美国Hyclone 公司；LipofectamineTM2000、青霉素/链霉素双抗、SuperScript ⅣFirst-Strand Synthesis System 试剂盒购于美国赛默飞公司；RNA 提取试剂盒（货号：DP424）购于北京天根生化科技有限公司；二甲基亚砜细胞冻存液（货号：ST1276）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution,PBS）（货号：C0221B）、0.25%胰蛋白酶（货号：C0209）、电转缓冲液（货号：P0021A）、电泳缓冲液（货号：ST466）、吐温20（货号：ST2789）、蛋白质裂解缓冲液（货号：P0013B）、PVDF 膜即聚偏二氟乙烯膜（货号：FFP19 和FFP24）、BCA 蛋白检测试剂盒（货号：P0010S）、电化学发光ECL 试剂盒（货号：P0018S）及Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒（货号：C0038）购于碧云天生物有限公司；细胞周期试剂盒（货号：KGA511）凯基生物有限公司；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（30～50 gels）（货号：AR0138）购于武汉博士德生物工程有限公司。LAMC1 干扰质粒及其阴性对照质粒购于上海和元生物技术股份有限公司。兔抗人LAMC1 单克隆抗体（货号：ab233389）、兔抗人cyclin D1 单克隆抗体（货号：ab134175）、兔抗人cyclin A 单克隆抗体（货号：ab181591）、兔抗人p16 单克隆抗体（货号：ab51243）、兔抗人p21 单克隆抗体（货号：ab109520）购于Abcam 生物公司。

1.4 研究方法

1.4.1 细胞培养及细胞转染 人膀胱癌细胞UMUC3、T24、5637 及J82 用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基进行培养。选择处于对数生长期的5637 细胞接种于6 孔板中，设置LAMC1 沉默组和阴性对照组，培养12～24 h 后待细胞融合度至60%时进行细胞转染，根据Lipofectamine 2000 说明书进行操作转染。待细胞转染6～12 h 后更换新鲜培养基，48 h 后收集细胞并提取RNA，采用实时荧光定量PCR 法和Western blot 验证LAMC1 mRNA 及蛋白表达水平，验证干扰质粒转染效果。

1.4.2 实时荧光定量聚合酶链式反应（real time quantity polymerase chain reaction，RTqPCR）常规培养细胞，设置LAMC1 沉默组和阴性对照组，使用RNA 提取试剂盒提取5637 细胞中的总RNA；使用SuperScript ⅣFirst-Strand Synthesis System试剂盒逆转录cDNA，使用SYBR Green 试剂盒在Bio-Rad IQ5 PCR 系统上进行Rt-qPCR 扩增。反应体系：cDNA 模板1 μl，SYBR Green Mix 10 μl，PCR 正反向引物（20 μmol/L）各1 μl，RNA 无酶水20 μl。PCR扩增条件为：95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，循环30次；95 ℃15 s；65℃1 min，以GAPDH 作为内参，用2-ΔΔCt方法计算目的基因LAMC1 mRNA 的相对表达量，RT-qPCR 引物由武汉金斯瑞生物公司合成，引物序列见表1。

表1 qPCR 引物序列

1.4.3 CCK-8 检测细胞增殖 取处于对数生长期的细胞进行实验，于96 孔板上接种5637 细胞（每组1×104个/孔），设置LAMC1 沉默组和阴性对照组，每组设置3 个复孔；向每孔加入10 μl CCK-8 溶液并置于恒温培养箱中孵育，37℃避光孵育2～3 h，使用酶联免疫检测仪分别在24、48、72 h 时间点每孔在450 nm波长处的OD 值，绘制细胞生长曲线。

1.4.4 克隆形成试验 用0.25%胰蛋白酶消化制作出单细胞悬液，使用细胞计数板对其进行计数，将500 个细胞数量/孔种植在6 孔板中，每组设置3 个复孔；2～3 周，每隔4 d 换1 次新的培养基。将6 孔板移出，用4%多聚甲醛固定、1%晶体紫染色、PBS 连续冲洗5～8 次，拍摄照片，计数克隆数目，取平均值。

1.4.5 流式细胞术检测细胞周期 于6 孔板上接种5637 细胞（每组1×105个/孔），培养24～72 h 后胰酶消化并收集细胞；PBS 洗涤2 次；70%冷乙醇置于冰箱内固定2 h，PBS 洗2 次，加入5 μl RNaseA（浓度为30mg/L）去除RNA 的影响，加入5μl 碘化丙啶（50 mg/L）染液避光孵育30 min；PBS 洗涤2 次，用600 μl PBS重悬细胞，最后流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

1.4.6 免疫组织化学法 采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法（streptavidin-perosidase，SP）检测LAMC1 表达，通过二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、过氧化氢离子水孵育、高温高压抗原修复，随后滴加兔抗人LAMC1 一抗（1∶100）4℃孵育过夜，次日滴加二抗室温孵育1 h。二氨基二苯胺显色，苏木精复染，胶封。阴性对照组则以相同剂量的PBS 替代一抗。在对免疫组织化学染色结果的解读过程中，由两名经验丰富的病理医生进行双盲读片，最后的免疫组织化学得分是以染色的强度及阳性细胞所占的比例这两项乘积。在显微镜下随机选择5 个高倍镜视野（400×），每个视野中计数100 个肿瘤细胞。染色强度评分：未着色为0 分，淡黄色为1 分，黄褐色为2 分，褐色为3分。阳性细胞所占的百分比：无阳性细胞为0 分；1%～25%为1 分；＞25%～50%为2 分；＞50%为3 分。LAMC1 表达强度的总分评判：＞4 分为高表达，≤4 分为低表达。

1.4.7 Western blot 实验5637 细胞用蛋白质裂解缓冲液溶解，并提取总蛋白质；用BCA 试剂盒检测蛋白质浓度并进行变性处理。然后将样品电泳，转膜，10%的脱脂牛奶密封，加入兔抗人LAMC1 单克隆抗体（1∶5 000）、兔抗人cyclin D1 单克隆抗体（1∶3 000）、兔抗人cyclin A 单克隆抗体（1∶4 000）、兔抗人p16 单克隆抗体（1∶2 000）、兔抗人p21 单克隆抗体（1∶2 000）在4℃下孵育过夜。TBST 洗膜3 次，每次10 min，用辣根过氧化物酶标记的二抗室温下孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min。最后用ECL 发光试剂盒显影。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（）表示，比较采用独立样本t检验；计数资料采用例数或百分比表示，比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LAMC1 mRNA 在膀胱癌细胞中的表达水平

RT-qPCR 检测结果显示，5637 细胞中LAMC1 mRNA 表达水平高于UMUC3、T24、J82 细胞（P＜0.05）。因此，本研究中选取表达水平最高的5637 细胞进行后续研究。

2.2 LAMC1 在膀胱癌组织及癌旁组织中的表达

LAMC1 在癌旁组织中呈现呈淡灰色或无着色，染色强度较浅，而在膀胱癌组织中呈棕色或棕褐色，染色强度较深（图2）。LAMC1 在膀胱癌组织中阳性表达率为64.58%（31/48），在癌旁组织中阳性表达率为35.41%（55/48），膀胱癌组织与癌旁组织中LAMC1阳性表达率比较，差异无统计学意义（χ2=1.54，P＞0.05）。

图2 层粘连蛋白γ1 在膀胱癌及癌旁组织中的表达水平

2.3 LAMC1 沉默稳定细胞株的建立

LAMC1 沉默组中的LAMC1 mRNA 和蛋白表达水平低于阴性对照组（P＜0.01）。见图3。

图3 RT-qPCR 和Western blot 检测转染LAMC1 siRNA 后膀胱癌细胞5637 中LAMC1 的mRNA 和蛋白表达水平（n=3）

2.4 沉默LAMC1 对5637 细胞增殖及克隆形成能力的抑制作用

CCK-8 法检测结果显示，LAMC1 沉默组在24、48、72 h 时间点的细胞增殖活力低于阴性对照组（P＜0.01）（图4A）。此外，细胞克隆形成实验结果显示，LAMC1 沉默组5637 细胞集落形成率低于阴性对照组（P＜0.01）（图4B～C）。

图4 CCK-8 法及克隆形成实验观察LAMC1 基因沉默对5637 细胞的增殖的影响（n=3）

2.5 流式细胞术检测沉默LAMC1 对膀胱癌细胞周期的影响

采用流式细胞术检测结果显示，LAMC1 沉默组中细胞中S 期细胞所占的百分比低于阴性对照组（P＜0.01），G1 期细胞所占的百分比高于阴性对照组（P＜0.01）。见图5。

图5 流式细胞术检测沉默LAMC1 表达对人膀胱癌5637 细胞周期的影响（n=3）

2.6 Western blot 检测沉默LAMC1 对膀胱癌细胞周期蛋白表达水平的影响

Western blot 检测结果显示，LAMC1 沉默组中cyclin D1 和cyclin A 蛋白的表达水平低于阴性对照组（P＜0.01），而p16 和p21 蛋白的表达水平高于阴性对照组（P＜0.01）。见图6。

图6 Western blot 检测干扰LAMC1 表达对膀胱癌5637 细胞周期蛋白表达水平的影响（n=3）

3 讨论

LAMC1 作为层粘连蛋白家族中的一员，由α、β和γ 链组成的三聚体化合物，是细胞外基质（extracellular matrixc，ECM）的重要调节因子，调控细胞黏附、迁移、分化及细胞增殖[13]。在肿瘤的发生与发展过程中，LAMC1 在肿瘤中高表达并促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[14-15]。Kashima 等[16]发现高级别子宫内膜癌的LAMC1 转录水平明显高于低级别子宫内膜癌，且LAMC1 的表达与子宫内膜癌FIGO 分期、肌层浸润、颈/附件受累、血管淋巴结侵犯及淋巴结转移有显著相关性。Ke 等[17]通过检测32 例不同病理亚型的脑膜瘤患者中LAMC1 的表达水平，发现LAMC1 在Ⅲ级脑膜瘤中的表达显著高于Ⅰ级脑膜瘤（P＜0.05），且LAMC1 的表达升高与肿瘤复发及无瘤生存期缩短呈正相关。提示LAMC1 可作为脑膜瘤复发和患者生存的预测指标，有可能成为治疗脑膜瘤的新靶点。Kinoshita 等[18]研究发现，LAMC1 在头颈部鳞状细胞癌中高表达，沉默LAMC1 表达可明显抑制癌细胞的迁移和侵袭能力。Nishikawa 等[19]发现LAMC1 在前列腺癌中高表达，进一步的研究表明，miR-29s 可通过直接靶向LAMC1 从而发挥抑制癌细胞的迁移和侵袭的作用。这些研究均表明，LAMC1 基因在不同肿瘤中的表达及其相关作用可能取决于肿瘤的类型和不同肿瘤细胞的特性[20-21]。虽然有研究报道了多种肿瘤存在LAMC1 表达异常，并初步阐明其在肿瘤中的大致作用；但LAMC1 在膀胱癌中表达如何，以及其在膀胱癌中的作用及其相关机制鲜见相关报道。

本研究免疫组织化学结果表明，LAMC1 在膀胱癌组织中的阳性表达率高于癌旁组织，提示其在膀胱癌中异常高表达，可能在膀胱癌的发生与发展过程中扮演癌基因的促癌作用。为了进一步证实LAMC1 对膀胱癌生物学功能的影响，本研究结果显示下调LAMC1 的表达明显抑制了5637 细胞的增殖能力和细胞集落形成能力；提示LAMC1 在膀胱癌中可能发挥促癌作用。

研究报道，正常细胞增殖严格有序地进行是通过细胞周期有规律地实现的，而肿瘤细胞的无限制增殖的相关机制与细胞周期的失控密切相关[22]。细胞周期是一个非常复杂的过程，其中由细胞周期蛋白（cyclin）、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖抑制性蛋白组成的细胞周期蛋白组成调控网络对细胞周期进程进行严格而有序的调控，从而控制细胞增殖进程[23-25]。细胞周期实验结果显示LAMC1沉默导致G0/G1期细胞周期阻滞，进而抑制细胞增殖；同时cyclin D1 和cyclin A 的表达明显下调，而p16 和p21 蛋白的表达水平增加。提示LAMC1 可能通过调控细胞周期相关蛋白的表达，从而促进膀胱癌细胞的快速增殖潜能。

综上所述，沉默LAMC1 基因表达后能够明显抑制膀胱癌5637 细胞的增殖和克隆形成能力，促使其发生G0/G1期细胞周期阻滞；其机制可能是调控细胞周期蛋白的表达引起细胞周期分布的改变而起作用，提示LAMC1 可作为膀胱癌潜在的分子治疗靶标。