过敏性鼻炎患儿血清miR-124-3p 和GATA3表达水平与疾病严重程度、Th1/ Th2 平衡的关系

陈玉卿 庄洁莲 姜善雨

江苏省无锡市妇幼保健院儿童保健耳鼻喉科，江苏无锡 214002

儿童过敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）又称变应性鼻炎，是儿童主要的呼吸道炎症疾病，主要临床表现为鼻痒、鼻塞、打喷嚏及头痛等症状，对儿童的生活质量造成很大影响[1-2]。目前关于AR 的发病机制尚未明确，多数研究认为与Ⅱ型辅助性T 细胞[typeⅠhelper T cell，Th1）/Ⅱ型辅助性T 细胞（type Ⅱhelper T cell，Th2）免疫失衡有关，纠正Th1/Th2 免疫失衡是防治AR 的关键[3]。微RNA（microRNA，miRNA）参与机体免疫炎症反应调节，作为疾病诊断与病情评估的分子标志物[4]。微RNA-124-3p（miR-124-3p）是一种重要的miRNA 之一，研究显示，miR-124-3p 与肿瘤发生、病毒感染、炎症反应等多种病理过程有关[5-6]。Hou 等[7]通过分析异丙托溴铵治疗AR 小鼠后miRNAs表达谱发现，miR-124-3p 表达水平显著升高，提示miR-124-3p 与AR 小鼠鼻黏膜过敏性免疫相关。GATA 结合蛋白3（GATA binding protein 3，GATA3）是一种转录因子，调控原初性T 细胞向Ⅱ分化，Th2 细胞在AR 中起着重要作用[8]。研究显示，使用携带miR-466a-3p 的慢病毒治疗AR 小鼠，miR-466a-3p可负调节GATA-3 表达，减轻小鼠AR 症状[9]。经生物信息学分析显示，miR-124-3p 与GATA3 有靶向结合位点，推测二者共同参与AR 的发生，本研究探讨AR患儿血清miR-124-3p、GATA3 表达与患儿疾病严重程度、Th1/Th2 平衡的相关性，为AR 的防治提供理论支撑。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2020 年6 月至2022 年4 月在江苏省无锡市妇幼保健院（以下简称“我院”）儿童保健耳鼻喉科确诊的AR 患儿87 例为观察对象（AR 组），其中男42 例，女45 例；年龄3～12 岁，平均（7.40±2.35）岁。按症状严重程度[10]分为轻度组53 例，中重度组34例。另选取同期在我院健康体检儿童85 名为对照组，其中男45 名，女40 名；年龄3～13 岁，平均（7.20±2.40）岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。纳入标准：①符合2019 年《儿童过敏性鼻炎诊疗——临床实践指南》[10]中的诊断标准，其中轻度AR 为对睡眠、学习等生活质量未产生明显影响，中重度AR 表现为症状较重或对生活质量产生影响；②临床资料完整；③所有患儿家长或监护人知情并同意。排除标准：①合并哮喘、肺结核等呼吸道疾病；②合并免疫系统疾病或其他慢性炎症性疾病；③近期使用免疫抑制剂；④肝肾功能不全。本研究获得我院医学研究伦理委员会的审核并批准（2022-01-0302-03）。

1.2 研究方法

1.2.1 样品采集及保存 采集AR 患儿确诊24 h 内及对照组儿童体检当日清晨空腹静脉血5 ml 各两份，其中一份3 000 r/min（离心半径15 cm），离心15 min，收集上清，置于-80℃冰箱保存备用。另一份加入淋巴细胞分离液，分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），检测Th1/Th2。

1.2.2 血清miR-124-3p 检测 采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测血清miR-124-3p 水平，RNA 提取试剂盒（德国Qiagen）提取血清的总RNA，紫外分光光度计检测总RNA 浓度及纯度，取2 μg 的RNA 使用miScript Reverse Transcription kit（德国Qiagen）反转录成cDNA，于-20℃冰箱保存。使用RT-PCR 试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）进行PCR 扩增，反应体系为50 μl，其中10×PCR Buffer 5 μl，dNTPs 1 μl，正反向引物各1 μl，DNA模板2 μl，Tap 酶0.5μl，加双蒸水至50μl。反应条件：95℃10min，38 个循环，94℃30 s，60℃30 s，70℃30 s。引物购自上海生物工程技术公司，miR-124-3p 正向引物（5’-3’）：CGACGTAAGGCACGCG；反向引物（5’-3’）：CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT；U6 正向引物（5’-3’）：CGAGCACAGAATCGCTTCA；反向引物（5’-3’）：CTCGCTTCGGCAGCACATAT。以U6 作为内参，采用2-△△Ct分析miR-124-3p 表达水平。

1.2.3 流式细胞术检测Th1/Th2 外周血经密度梯度离心分离PBMCs，分别加入PE/Cy5 表示的-CD3 抗体和FITC 标记的CD8 抗体孵育20 min，经裂解，破膜后，分别加入PE 标记的γ 干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、PE 标记的白细胞介素4（interleukin-4，IL-4）抗体标记细胞，抗体购自美国BD 公司，采用FACS 型流式细胞仪检测，以IFN-γ、IL-4 表示Th1、Th2 细胞比例，并计算Th1/Th2。

1.2.4 其他指标检测 采用酶联免疫吸附法检测血清IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-5、IL-10、GATA3 水平，IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-5、IL-10 检测试剂盒均购自Abcam公司，GATA3 检测试剂盒购自武汉楚锐科药业科技有限公司，严格按照相应试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，采用t 检验。计数资料以例数或百分比表示，采用χ2检验。AR 患儿血清miR-124-3p 表达与GATA3 相关性、miR-124-3p、GATA3 与Th1/Th2 及细胞因子相关性采用Pearson 法分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-124-3p、GATA3 水平比较

AR 组血清miR-124-3p 表达水平低于对照组，GATA3 水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；中重度组血清miR-124-3p 表达水平低于轻度组，GATA3 水平高于轻度组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组血清miR-124-3p、GATA3 水平比较（）

表1 两组血清miR-124-3p、GATA3 水平比较（）

注 与对照组比较，aP＜0.05；与轻度组比较，bP＜0.05。MiR-124-3p：微RNA-124-3p；GATA3：GATA 结合蛋白3；AR：过敏性鼻炎。

2.2 AR 组与对照组外周血Th1、Th2 细胞比例及Th1/Th2 比较

AR 组Th1 细胞比例和Th1/Th2 比值低于对照组，Th2 细胞比例高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 AR 组与对照组外周血Th1、Th2 细胞比例及Th1/Th2 比较（）

表2 AR 组与对照组外周血Th1、Th2 细胞比例及Th1/Th2 比较（）

注AR：过敏性鼻炎；Th：辅助性T 细胞。

2.3 AR 组与对照组Th1、Th2 细胞因子水平比较

AR 组血清IFN-γ、IL-12 水平低于对照组，IL-4、IL-5、IL-10 水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 AR 组与对照组Th1 与Th2 细胞因子水平比较（ng/L，）

表3 AR 组与对照组Th1 与Th2 细胞因子水平比较（ng/L，）

注AR：过敏性鼻炎；IFN-γ：γ 干扰素；IL：白细胞介素。

2.4 AR 患儿miR-124-3p、GATA3 水平相关性

相关性分析显示，AR 患儿血清miR-124-3p 表达水平与GATA3 水平呈负相关（r=-0.495，P＜0.05），见图1。经starbase 分析显示，miR-124-3p 与GATA3有靶向结合位点，见图2。

图1 AR 患儿miR-124-3p、GATA3 水平相关性

图2 miR-124-3p 与GATA3 靶向结合位点

2.5 AR 患儿miR-124-3p、GATA3 表达与Th1/Th2及细胞因子相关性分析

相关性分析显示，miR-124-3p 与Th1、Th1/Th2、IFN-γ、IL-12 呈正相关（r＞0，P＜0.05），与Th2、IL-4、IL-5、IL-10 呈负相关（r＜0，P＜0.05）；GATA3 与Th1、Th1/Th2、IFN-γ、IL-12 呈负相关（r＜0，P＜0.05），与Th2、IL-4、IL-5、IL-10 呈正相关（r＞0，P＜0.05）。见表4。

表4 AR 患儿中miR-124-3p、GATA3 表达与Th1/Th2及细胞因子相关性分析

3 讨论

AR 患儿的过敏症状易与普通感冒混淆，不能得到及时、规范治疗，且患儿往往伴有哮喘、结膜炎等多类疾病，给儿童生活造成很大困扰，研究认为AR 的发病机制与Th1 和Th2 细胞免疫失衡有关[11-12]。

miRNA 通过对靶基因的调控参与多种疾病的病理过程[13]。miR-124-3p 是miRNA 的一种，在系统性红斑狼疮、动脉粥样硬化等疾病中异常表达，成为疾病诊断的标志物[14-15]。银屑病是一种T 细胞介导皮肤病，研究显示，miR-124-3p 在寻常型银屑病患者皮损组织表达水平降低，与皮损面积和严重程度相关[16]。Zhang 等[17]研究显示，miR-124-3p 在AR 模型小鼠鼻黏膜组织中下调表达，上调miR-124-3p 表达，可缓解AR 症状及降低血清炎症因子水平。GATA3 属于Ⅳ型锌指蛋白家族，是Th2 细胞发育过程中重要的转录因子，可以促进Th2 相关细胞因子的表达与分化，在免疫调节中发挥重要作用[18]。研究显示，GATA3 在AR小鼠肺组织中表达水平升高，给予玉屏风散治疗后，GATA3 蛋白的表达降低，提示GATA3 在参与AR 的免疫调节中发挥作用[19]。本研究结果显示，miR-124-3p在AR 患儿血清表达水平低于对照组，GATA3 水平高于对照组，且与轻度组比较，中重度组患儿血清miR-124-3p 表达水平显著降低，GATA3 水平显著升高，提示miR-124-3p、GATA3 与AR 患者病情严重程度有关。

正常生理条件下，Th1 和Th2 细胞处于相对平衡，保持机体免疫平衡，Th1 和Th2 细胞既互相拮抗又互相调节，机体在外界病原菌或过敏原刺激下，Th1/Th2 比例失衡导致机体免疫应答异常，引发疾病，Th1 和Th2 的免疫失衡是AR 的主要免疫学基础与发病机制[20-21]。Th1 细胞主要分泌肿瘤坏死因子β（tumor necrosis factor，TNF-β）、IFN-γ、IL-2、IL-12 等细胞因子，介导细胞免疫，参与迟发型超敏性炎症的形成，而Th2 细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等细胞因子，介导体液免疫。研究显示，AR 患者血清Th1 细胞亚群比例、Th1/Th2 比例、IL-4、IL-12 水平升高[22]。本研究结果显示，AR 组Th1 细胞比例和Th1/Th2 显著降低，Th2 细胞比例显著升高，提示AR患儿体内Th1/Th2 比例失衡，Th2 细胞可能在AR 疾病中占免疫优势。Th1 和Th2 免疫调节主要通过其细胞因子发挥作用，李满群等[23]研究显示，过敏性鼻炎患儿血清TNF-β、IFN-γ、IL-2、IL-12 水平显著降低，血清IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 水平显著升高，存在Th1/Th2 免疫失衡。本研究结果显示，AR 组血清IFN-γ、IL-12 水平显著降低，IL-4、IL-5、IL-10 水平显著升高，与李满群等[23]研究结果类似，提示AR 患儿体内有炎症反应，Th1/Th2 免疫失衡。

Th1/Th2 失衡参与AR 发病的具体机制尚不清楚。本研究经相关性分析显示，AR 患儿血清miR-124-3p表达水平与GATA3 水平呈负相关，且经生物学软件在线分析显示，miR-124-3p 与GATA3 有靶向结合位点，miR-124-3p 可能靶向负调控GATA3 表达。进一步研究显示，miR-124-3p、GATA3 与Th1/Th2 失衡相关。研究显示，富含miR-124-3p 外泌体可增强结直肠癌荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫反应，miR-124-3p 的过表达可促进Th1 细胞分化[24]。Th 前体细胞分化受GATA3 的转录调控，GATA3 可促进Th2 细胞的分化，并抑制IFN-γ 的生成[25]。因此，推测miR-124-3p 可能靶向负调控GATA3 表达，影响Th1、Th2 细胞分化，导致Th1/Th2 失衡，参与AR 病情进展。

综上所述，AR 患儿血清miR-124-3p 表达水平降低，GATA3 水平升高，二者与患儿疾病严重程度和Th1/Th2 失衡有关。但miR-124-3p 与GATA3 具体作用机制需要做进一步研究。