中国拉祜族PP1PK 血型频率调查*

胡海霞 范亮峰 方成江 向东 吴丹(.普洱市中心血站 云南 普洱 665000；.上海市血液中心)

我国是多民族国家，云南省是个多民族的地区，拉祜族是我国最古老的民族之一。 p 血型是P1Pk 及GLOB 血型系统中的罕见表型，一般来说，p 血型个体的血清中天然存在抗-PP1Pk(原称抗-Tja，下均称抗-PP1Pk)。 该抗体具有临床意义，可凝集除p 表型之外的所有表型红细胞，并能结合补体造成溶血，能引起严重的输血反应，可引起孕产妇早期流产和胎儿新生儿溶血病(hemolytic disease of the fetus and newborn，HDFN)[1]。 p 血型在世界各地均相当罕见，欧州每百万人中口中有5.8 例，我国香港100 万人只筛到1 例，目前在我国发现p 血型共10 多例，各地仅有个案研究报道[1-10]，在中国人群中的频率分布尚未清楚[6]。 若此类患者需要异体输血时，常规血库无法提供匹配血液制品，需要稀有血库调配血源或寻找相同血型的人互助。 为此我们与上海血液中心输血研究所联合对本市的拉祜族进行P1PK、GLOB 血型系统稀有血型调查，现报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2023 年2 月，经血站伦理委员会审核通过并与实验对象签署知情同意书后，随机抽取云南省普洱市澜沧拉祜族自治县世居拉祜族人群无关个体300 人(男性109名，女性191 名))，年龄8～68 岁，平均年龄38 岁，每人抽取EDTA-K2抗凝静脉血10 mL，4℃储存备用。

1.2 试剂与仪器 单克隆抗-A、抗-B 试剂(北京金豪制药股份有限公司，批号:202100702)； 抗-H 试剂、抗-D 试剂、抗-P1试剂、抗人球蛋白试剂、ABO 细胞、抗体筛选细胞、红细胞血型抗体鉴定谱细胞1、二巯基乙醇应用液(上海血液生物医药 有 限 责 任 公 司， 批 号 分 别 为: 20210917、 20211805、20211018、 20215001、 20225355、 20227003、 20211129、20217701)，红细胞血型抗体鉴定谱细胞2(Sanquin Reagents，批号:8000455431)，抗人球蛋白微柱凝胶卡(奥森多公司，批号:IGC131F)，自制AB 型人源性抗-PP1Pk 试剂(效价:为IgM “8”；IgG“16”)、O 型p 型红细胞由上海市血液中心输血研究所血型检测中心制备提供。 以上市售试剂均在有效期内使用，自制试剂均质检合格后使用。 STAR LET 全自动加样仪(瑞士Hamilton 公司)，SUNRISY 酶标仪(瑞士帝肯公司)，TD4-Ⅱ血型离心机(平凡科技)，2402 血型离心机(BASO 公司)，Ortho Workstation(奥森多公司)， system 9700 PCR 扩增仪(Applied Biosystems)。

1.3 方法

1.3.1 血清学试验

1.3.1.1 ABO 及RHD 血型定型试验 使用单克隆抗-A、抗-B 试剂、抗-D 试剂及ABO 细胞采用96 孔微板法，对拉祜族人群进行ABO 血型正反定型试验及RhD 定型试验。

1.3.1.2 其他血型定型试验 使用单克隆抗-H 试剂、抗-P1试剂、自制人源性抗-PP1Pk试剂同时采用盐水试管法和抗人球蛋白微柱凝胶卡法分别检测红细胞H 抗原、P1抗原及P抗原。

1.3.1.3 抗体筛选、抗体鉴定试验及效价测定 使用抗筛细胞、谱细胞、p 型红细胞。 采用试管抗球蛋白法和抗人球蛋白微柱凝胶卡法进行抗体筛选、抗体鉴定试验。 部分受检者标本检出抗-PP1Pk后，采用盐水试管法和抗人球蛋白微柱凝胶卡法进行IgM、IgG 抗体效价测定。

1.3.2 分子生物学检测 参照GenBank 中P1PK 血型A4GALT 基因序列(NC000022)，用Primer Prermier 软件设计基因编码区测序引物和进行PCR 扩增，对A4GALT 基因第3外显子作正反双向测序。 序列比对分析采用DNAMAN 软件分析测序结果，测序结果与GenBankAJ245581 参考序列比对，以确定受检者单核苷酸多态性(SNP)。

2 结果

2.1 ABO 正反定型与RhD 血型检测 300 份拉祜族无关个体血液标本，正反定型试验中292 份正反定型结果相符，检出A 型63 份，B 型119 份，AB 型18 份，O 型100 份，均为RhD 阳性。 其中8 份反定型中受检者血浆与Oc 均呈现阳性反应，凝集强度为“1＋～2＋”(参见AABB Technical Manual 14th，下同)，提示受检者标本或含ABO 血型以外的意外抗体，和自身红细胞不凝，可排除冷抗体或自身抗体，见表1。

表1 8 份ABO 正反定型不符合受检者标本血型血清学检测结果

2.2 抗-PP1Pk、抗-P1、抗-H 试剂血型鉴定 使用抗-PP1Pk、抗-P1试剂检测300 份受检者标本P1血型和P 血型，其中与抗-P1呈阳性55 份，呈阴性245 份。 与抗-PP1Pk试剂血清学呈阳性反应294 份，提示血清表型为P 型；呈阴性反应6 份，抗-P1反应性也均呈阴性，提示血清表型为p 血型，6 份受检者标本血型初步定为:2 份O 型p 血型、3 份B 型p 血型、1 份A 型p 血型。 云南地区少数民族人群类孟买血型频率相对较高，进行H 抗原检测，300 份受检者标本中检出2 份H抗原阴性，其余凝集强度为“3＋～4＋”，经血清学确认均为类孟买血型(Ohm)(下不再细述)，见表1。

2.3 抗体筛选试验与意外抗体鉴定试验

2.3.1 抗体筛选试验 300 份受检者血浆做抗体筛选试验(Ⅰc、Ⅱc、Ⅲc)，其中292 份受检者血浆在盐水试管法、抗人球蛋白微柱凝胶卡介质中抗筛试验呈阴性反应，提示血浆中未检出意外抗体；6 份抗-PP1Pk阴性受检者血浆与Ⅰc、Ⅱc、Ⅲc 细胞在盐水试管法、抗球蛋白微柱凝胶卡介质中抗体筛选试验均呈阳性(2＋、4＋)反应，且自身对照均阴性，提示血浆中含有意外抗体。

2.3.2 意外抗体鉴定试验 将6 份抗-PP1Pk阴性、意外抗体阳性受检者血浆进行抗体鉴定试验，使用前述2 组谱细胞，另添加2 个不同人的新鲜O 型p 血型红细胞入组，共28 个红细胞进行抗体鉴定试验。 2 组谱细胞26 个红细胞均为P血型，结果均呈现阳性凝集反应，单个受检者凝集强度均呈现反应均一性，抗人球蛋白微柱凝胶卡法反应强度均“3＋～4＋”。 因标本采集EDTA 抗凝血原因，受检者血浆中添加新鲜AB 型血清后，进行抗体鉴定试验时可观察到溶血反应现象，本6 份标本在谱细胞1 中添加新鲜AB 型血清37℃3 min后见溶血现象。 6 份受检者血浆与O 型p 表型红细胞在盐水(试管法)和微柱凝胶卡法均呈阴性反应，以上血清学试验结果符合抗-Tja格局，见表2。

表2 6 份受检者标本血清学检测结果

2.3.3 抗体效价测定 对6 份受检者标本进行抗体效价测定，盐水凝胶卡法:IgM 抗体效价:1 ∶4至1 ∶16；将受检者血浆经2-Me 处理后用抗球蛋白凝胶卡(IAT)进行实验:测得IgG抗体效价为:1 ∶4～1 ∶32，见表2。

2.4 基因测序 6 份受检者标本p 血型进行P1PK 血型A4GALT 基因测序，均为A4GALT 基因第3 外显子的559 位处G＞C(GGC＞CGC)等位基因突变的纯合态，见图1。

图1 6 份受检者标本基因测序结果

2.5 结论 300 名拉祜族人群的p 血型调查发现6 例p 血型，表现频率为2.0%(6/300)。

3 讨论

P 血型系统的多态性在由Landsteiner 和Levine 在1927年发现。 此后国际输血协会(ISBT 2011)将P 血型相关血型系统重新分类。 PIPK 血型系统(编号:ISBT 003)有P1、PK、NOR 抗原，均由A4GALT 基因编码酶诱导抗原的合成。GLOB 血型系统(编号:ISBT 028)P、PX2 抗原，由B3GALNT1基因编码诱导合成。 缺乏P1PK 血型系统所有抗原即为p血型。 截止2022 年，中国大陆文献报道p 血型10 余例，均为个例研究报道[1-10]，未见我国人群p 血型频率筛查报告。本文拉祜族人群的p 血型筛查，表现频率为2.0%，明显高于中国香港(p 血型频率约为1 人/100 万人)和欧洲(p 血型频率约为5.8 人/100 万人)，民族特异性和地域种族多态性比较显著。

几乎所有报道[1-10]p 血型血清中均存在天然抗-PP1Pk，这种抗体可凝集除p 血型细胞外的所有表型红细胞，并能结合补体造成溶血，能引起严重的输血反应。 抗-PP1Pk常含IgM 和IgG2 种成分。 我们检出的6 份受检者p 血型血浆中均存在抗-PP1Pk，均有IgM 和IgG 类抗体。 p 血型人若为孕产妇IgG 类抗体能通过胎盘屏障，易引发早期流产或胎儿新生儿溶血[1-10]。 本调查检出2 男4 女，通过走访咨询4 位女性受检者的妊娠与生育情况(其中最多1 人妊娠10 次，流产7 次，死胎3 次，1 人不孕不育，平均妊娠6 次，流产5 次，死胎1 次，其中1 人育1 女，其余3 人流产后未育)，说明抗-PP1Pk是导致妊娠早期女性的习惯性流产或死胎的重要原因。 在临床上，此类抗体常引起抗筛阳性、定型、配血困难，因p 血型患者体内含有抗-PP1Pk，因此，不能接受普通的血，只能接受相同p 血型的血液，否则会引起严重的输血反应。p 血型的患者需要输血时，只能依靠自身贮血或寻找相同血型的人进行互助或通过中国稀有血型网站(http:/ /www.chinarareblood.cn/)，为患者跨区域乃至国际合作，解决输血难题已可进行，为临床稀有血型患者的输血提供更有效的安全保障[11]。 目前由于p 血型的人极其罕见，稀有血库也稀罕，为临床供血还是有一定的难度。

本次调查显示在300 名拉祜族人群中检出6 例p 血型，频率高达2.0%，在中国乃至世界尚属首次，可能与这个民族习俗、生存环境有关，或也不排除拉祜族祖先在特定时段内人数较少，由“奠基者效应”造成pp基因分布的偏移，也可能受生活环境影响，各种病原微生物、寄生虫(如:包虫)在漫长民族进化史上对特定血型造成选择压力，引起血型分布的变化[12]。 总之，云南拉祜族作为一个长期相对封闭的人群，其特殊的血型分布值得深入探索。 同时，是否还存在其他罕见的基因学乃至体质人类学特征，值得人类学家进一步研究。

基因测序显示:6 例p 血型均为A4GALT基因第3 外显子的559 位处G＞C 等位基因突变，与报道的一致[1-5]。 拉祜族一般不与外族通婚，据调查拉祜族大家庭内通婚一直维持到20 世纪90 年代未，之后虽然3 代内不通婚，但族内通婚依然存在，势必造成区域内出现携带含p 杂合子基因的人较多，这就有了p 血型遗传的分子基础，是造成p 血型高频率的原因。 上述表现频率说明该民族在该地域人群中的p 隐性基因频率较高，具有一定的民族特征和地域分布特征。 因此对该民族群体P1PK 血型系统调查，不仅为人类学和医学遗传学提供基本资料，还了解和掌握中国人群该民族p 血型稀有血型分布情况，对推动本地临床治疗(特别对孕产妇、胎儿新生儿溶血)、输血医学、免疫血清学、遗传学等方面的研究和发展有着积极作用，说明还是有民族地域差异性。

p 表型血型在人群中十分罕见血型，其血清学表现与ABO 血型有很大差异，在临床配血、用血时常常造成定型、配血困难，用血更难。 在我们此种血型较高频率的边疆少数民族地区，开展此血型调查和检测工作，为少数民族患者临床输血安全、孕产妇提供妊娠建议及备(用)血指导，或为我国稀有血型患者提供安全输血治疗的血源资料储备和共享都具有重要意义。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。