基于谱效关系和成分敲除探讨独一味总黄酮抗类风湿关节炎的关键成分

陈瑞鑫,康点点,詹琥珀,蒋桂华,3*,蒋运斌*

1成都中医药大学药学院 西南特色中药资源国家重点实验室,成都 611137;2西南大学药学院中医药学院,重庆 400000;3成都中医药大学民族医药学院,成都 611137

中药独一味(Lamiophlomis Herba,LH)为唇形科植物独一味Lamiophlomisrotata(Benth.) Kudo的干燥地上部分,系藏族习用药材,也常作中药使用。《中华人民共和国药典》2020年版载其具有活血止血、祛风止痛的功效,可用于治疗跌打损伤、风湿痹痛、黄水病[1]。其藏药名“大巴”“打布巴”,先后记载于藏医著作《月王药诊》《四部医典》《晶珠本草》等,迄今已有1 200年的应用历史[2];《晶珠本草》中记载“独一味,固精髓,引流黄水”[3],表明独一味可应用于“黄水病”的治疗。而根据临床表现,藏医记载的“黄水病”可归属于中医学“痹证”范畴,由“痹证”发展而来的“骨痹”、“历节病”等与现代医学中“类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)”临床特征性表现更为贴近[4]。因此,独一味具有治疗RA的潜力[5],现有研究也表明了独一味具有抗RA的药效[6-8]。

RA是一种以慢性、多发性关节炎症为主要表现的自身免疫性疾病,其病理特点表现为滑膜细胞“肿瘤样”增生以及血管翳的形成,其中成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)是其主要的效应细胞[9]。目前,RA的发病机制尚不明确,其发病率和致残率均较高,且通常潜伏发病,疾病晚期可能导致不同程度无法逆转的残疾,属世界卫生组织规定的现代难治病[10]。临床上常用于治疗RA的化学药物如非甾体抗炎药、免疫抑制剂、糖皮质激素和生物制剂,前3种化学药物不良反应明显,而生物制剂昂贵的价格限制了其长期应用[11]。故开发临床新型低副作用且疗效稳定的抗RA药物显得尤为必要。

课题组前期首次采用网络药理学对独一味抗RA的药效物质基础和作用机制进行了探讨,发现独一味对RA的治疗作用与其23种成分相关,其中黄酮类成分数量占比接近40%,提示黄酮类成分在独一味抗RA的过程中发挥了重要作用,尤其是木犀草素;并提出独一味抗RA的主要机制可能是通过抑制PI3K-Akt信号通路诱导滑膜细胞凋亡[12]。同时,通过大鼠佐剂性关节炎模型对独一味抗RA的作用及药效物质基础进行了研究,结果表明独一味总黄酮具有良好的抗RA作用[13]。独一味总黄酮可能是其抗RA的主要药效物质基础之一,但独一味总黄酮中抗RA的关键药效成分还不明确,亟待进一步研究。因此,本研究拟通过谱效关系和成分敲除技术,对独一味总黄酮中抗RA的关键成分进行探讨,旨在为临床运用独一味治疗RA提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药材及样品制备

13批不同产地独一味药材样品信息见表1,所有样品经成都中医药大学药学院蒋桂华教授鉴定为唇形科植物独一味Lamiophlomisrotata(Benth.) Kudo的干燥地上部分。

表1 独一味样品信息

独一味总黄酮样品的制备:取独一味药材粉末100 g加入渗漉桶中,加入95%乙醇水没过粉末,静置24 h后开始提取。95%乙醇水适当流速渗漉,收集渗漉液,于50 °C减压旋转蒸发回收溶剂,待回收至约30 mL时将浓缩的渗漉提取液与预处理的聚酰胺粉拌匀,在50 °C水浴蒸干,上样于已处理好的聚酰胺色谱柱,放置24 h。先以高纯水(3倍柱体积)洗脱至无色,然后用70%乙醇水溶液(14倍柱体积)洗脱,并收集70%乙醇水洗脱液,减压浓缩,即得独一味总黄酮。基于该方法课题组制备得到的13批独一味总黄酮纯度范围在55.82%～94.12%,纯度平均值为80.62%。

1.1.2 仪器

Ultimate 3000高效液相色谱仪(美国赛默飞世尔科技公司);KQ-500VDE双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);XSP-37XB倒置生物显微镜(上海民仪电子有限公司);SYNERGY H1BioTek多功能微孔板检测仪(安捷伦科技有限公司);ZF-90紫外分析仪(温州奥利生物医学仪器厂)。

1.1.3 试剂与试药

色谱纯乙腈(美国TEDIA公司);色谱纯甲酸(成都市科隆化学品有限公司);超纯水;分析纯甲苯、甲酸乙酯、甲酸、三氯化铝(成都市科隆化学品有限公司);二甲基亚砜(河北品科研生物科技有限公司);Fetal Bovine Serum血清(天杭生物有限公司);DMEM高糖培养基(武汉塞维尔生物科技有限公司)。

对照品木犀草苷(批号MUST-21111817)、木犀草素(批号:MUST-21072311)、绿原酸(批号:MUST-21070910)购自成都曼思特生物科技有限公司;CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.1.4 实验细胞

人滑膜组织由中山大学附属第一医院风湿免疫科肖游君副主任医师提供,其取自正在接受膝关节滑膜切除术或全膝关节置换术的活动期RA患者(患者年龄在35～68岁之间);中山大学附属第一医院医学伦理委员会批准了本研究中涉及的所有研究方案(No.[2017]-049)。

将取自RA患者的滑膜组织精细切成小片,用胶原酶(1 mg/mL)在37 ℃消化3 h,终止消化后,分离FLS细胞,将其置于10% FBS(胎牛血清)的DMEM高糖培养基于5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。

1.2 实验方法

1.2.1 独一味总黄酮指纹图谱的建立

1.2.1.1 色谱条件

Waters Symmetry C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm);流动相A为乙腈,流动相B为0.2%甲酸水溶液,梯度洗脱(0～15 min,8%→13% A;15～25 min,13% A;25～35 min,13%→17% A;35～55 min,17% A;55～70 min,17%→38% A;70～80 min,38% A);检测波长为245 nm;流速为1.0 mL/min;柱温为29 ℃;进样量为10 μL。

1.2.1.2 供试品溶液的制备

取13批独一味总黄酮样品各0.1 g,精密称定,置于25 mL容量瓶中,加甲醇超声溶解,定容,混匀,过滤,取续滤液过0.22 μm微孔滤膜即得。

1.2.1.3 对照品溶液的制备

精密称定木犀草苷、木犀草素、绿原酸对照品3 mg,置于10 mL容量瓶中,加甲醇配置成0.3 mg/mL的对照品溶液,摇匀过0.22 μm滤膜,即得。

1.2.1.4 方法学考察

精密度考察:取独一味总黄酮样品(S1),按“1.2.1.2”项下方法制备供试品溶液,按“1.2.1.1”项下色谱条件连续进样6次,并记录HPLC图谱。

重复性试验:取独一味总黄酮样品(S1)6份,按“1.2.1.2”项下方法制备供试品溶液,按“1.2.1.1”项下色谱条件进样分析,并记录HPLC图谱,考察该方法的重复性。

稳定性试验:取独一味总黄酮样品(S1),按“1.2.1.2”项下供试品溶液制备方法,分别于制样后0、2、4、8、12、24 h按“1.2.1.1”项下色谱条件记录HPLC图谱,考察样品稳定性。

1.2.2 独一味总黄酮对RA-FLS细胞活力的影响

1.2.2.1 样品的制备

取不同批次独一味总黄酮样品,使用前溶解于DMSO中,再配制成所需浓度的含药细胞培养液。

1.2.2.2 细胞培养与分组

RA-FLS细胞的分离、培养与鉴定参照已有研究方法[14,15],设不含细胞和药物的空白组、含细胞不含药物的对照组和不同批次独一味总黄酮给药组(64 μg/mL),采用显微镜观察细胞生长状态,将生长良好的FLS细胞进行计数,并采用DMEM高糖培养基调整细胞密度为5×104个/mL,将悬浮好的细胞,以每孔100 μL接种于96孔培养板进行培养。给药组加入对应浓度的独一味总黄酮,空白组和对照组加入等体积的含DMSO培养液。

1.2.2.3 独一味总黄酮对RA-FLS细胞活力的影响

待细胞生长贴壁,弃去培养基,用0.1% DMSO溶解独一味总黄酮,使其在加入细胞培养孔后的浓度为64 μg/mL,每孔100 μL,孵育48 h后,每孔加入10 μL CCK-8试剂,置于5% CO2、37 ℃恒温培养箱中2 h。使用多功能微孔板检测仪在450 nm波长测定吸光度,按照公式(1)计算细胞活力。

细胞抑制率=

(A对照-A试验)/(A对照-A空白)× 100%

(1)

其中,A对照为细胞未经药物处理组的吸光度值,A试验为细胞经药物处理组的吸光度值,A空白为空白组,即无细胞、无药物组的吸光度值。

1.2.2.4 数据分析方法

采用SPSS软件进行数据分析,数据以均数±标准差(¯x±s)表示,服从正态分布且方差齐的数据采用单因素方差分析(ANOVA),组间比较采用LSD,当P<0.05表示差异具有统计学意义。

1.2.3 独一味总黄酮抗类风湿关节炎谱效关系的建立

将独一味总黄酮指纹图谱共有峰峰面积和对应FLS细胞活力抑制率数据组成原始数据矩阵,进行灰色关联度分析和偏最小二乘回归分析,建立独一味总黄酮抗类风湿关节炎的谱效关系。

1.2.4 基于成分敲除研究独一味总黄酮抗类风湿关节炎的关键成分

在基因敲除模式的影响下,成分敲除技术被逐渐引入到中药药效物质基础的研究中,该技术具有明显的中医药特色,可将中医药理论的整体观、系统观运用于实际,并突显中医药多成分协同拮抗的丰富内涵[16]。木犀草素为木犀草苷的糖苷元,可能是由于天然黄酮类成分常以苷类形式存在[17],独一味总黄酮HPLC图谱中木犀草苷含量明显高于木犀草素。基于此,本研究拟采用薄层敲除法对独一味总黄酮中木犀草苷成分进行成分敲除,考察木犀草苷是否为独一味总黄酮抗类风湿关节炎的关键成分。

1.2.4.1 对照品溶液的制备

取木犀草苷对照品0.4 mg,精密称定,以70%乙醇水制备成含木犀草苷0.04 mg/mL的对照品备用溶液。

1.2.4.2 供试品溶液的制备

取独一味总黄酮0.04 g,置于10 mL容量瓶中,加70%乙醇水溶解,摇匀,作为供试品溶液。

1.2.4.3 薄层色谱条件

展开剂选用甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸(2∶4∶1),显色剂应用5%的三氯化铝乙醇溶液,在紫外光灯(365 nm)下对木犀草苷予以鉴定。

1.2.4.4 敲除样品的制备

用注射器吸取适量供试品溶液画线于活化的硅胶板,另用毛细管吸取供试品溶液和对照品溶液分别点于画线条带的两端。将硅胶板放入已用展开剂饱和的层析缸中,展开,取出,晾干。将画线条带部分以玻璃板覆盖,于硅胶板两端部位喷以显色剂,加热1 min后置紫外灯下检视。

挖取未喷显色剂的目标成分色带部分(与木犀草苷对照品显相同斑点的色带部分)并合并其他色带部分得目标成分和目标阴性成分的硅胶混合物,如图1。另取硅胶板点样,展开后刮取全部硅胶,得独一味总黄酮的硅胶混合物。

图1 敲除样品制备图Fig.1 Knockout sample preparation chart注:样品S1及木犀草苷对照品(左);去除目标成分条带(中);目标阴性成分(右)。Note:Sample S1 and luteoloside reference substance (left);Stripes for removing target components (middle);Target negative component (right).

1.2.4.5 敲除样品的成分表征

在薄层板上挖取并合并足够量的吸附有目标成分、目标阴性成分和独一味总黄酮全成分样品的硅胶,分别置于具塞锥形瓶中,加入5倍量甲醇,超声提取3次,每次1 h,合并提取液。将提取液于8 000 r/min离心5 min,合并上清液,浓缩,以甲醇定容至2 mL,过0.22 μm微孔滤膜两次,即得目标成分、目标阴性成分和独一味总黄酮全成分的样品溶液。采用HPLC对目标成分、目标阴性成分和独一味总黄酮全成分样品溶液中的成分进行表征。HPLC色谱条件同指纹图谱研究条件,进样量为60 μL。

1.2.4.6 敲除样品的细胞药效学研究

RA-FLS细胞药效学实验方法同“1.2.2”。

1.2.5 等摩尔量木犀草苷和木犀草素对FLS细胞活力的影响

基于谱效关系结论,通过查阅相关文献[18],本研究拟对比20 μmol/L的木犀草苷与20 μmol/L木犀草素对FLS细胞活力影响的差异,以更好地阐明独一味总黄酮抗类风湿关节炎的药效物质基础。

1.2.5.1 样品制备

取木犀草苷或木犀草素适量,精密称定,用0.1% DMSO溶解,使其在加入细胞培养孔后的浓度为20 μmol/L。

1.2.5.2 细胞药效学研究

基于CCK-8法考察20μmol/L木犀草苷和20 μmol/L木犀草素成分对FLS细胞活力的影响,实验步骤同“1.2.2”。

2 实验结果

2.1 独一味总黄酮指纹图谱的建立

2.1.1 方法学考察结果

方法学考察结果显示重复性、稳定性、精密度RSD均小于3.0%,表明该方法良好,可用于独一味总黄酮指纹图谱的研究。

2.1.2 指纹图谱的建立

将13批独一味总黄酮的HPLC色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.130723》,设置S3号样品为参照图谱,以中位数为对照指纹图谱生成方法,时间窗口宽度为0.1 min,通过多点校正和自动匹配生成了指纹图谱对照图谱,确定了8个共有峰,13批独一味总黄酮色谱叠加图见图2,样品图和对照品图见图3。

图3 混合对照品及独一味总黄酮样品的HPLC图Fig.3 HPLC chromatogram of mixed reference substance and total flavonoid sample from LH注:A:混合对照品;B:独一味总黄酮样品;1:绿原酸;4:木犀草苷;8:木犀草素。Note:A:Mixed reference solution;B:Total flavonoid sample of LH;1:Chlorogenic acid;4:Luteoloside;8:Luteolin

2.1.3 相似度评价

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.130723》对13批独一味总黄酮HPLC指纹图谱与对照指纹图谱进行相似度评价,相似度计算结果依次为:0.999、0.996、0.997、0.986、0.998、0.980、0.909、0.974、0.991、0.983、0.988、0.990、0.969,均大于0.9,表明各批次指纹图谱与对照指纹图谱有较好的相似性。

2.2 独一味总黄酮对RA-FLS细胞活力的影响

统计学分析结果,与对照组比较,各批次独一味总黄酮均能显著抑制FLS细胞的活力,不同批次独一味总黄酮细胞活力抑制率见表2。

表2 不同批次独一味总黄酮对FLS细胞的抑制率(¯x ± s, n = 3)

2.3 独一味总黄酮抗类风湿关节炎谱效关系的建立

2.3.1 灰色关联度分析

将13批独一味总黄酮共有峰峰面积及对应FLS细胞活力抑制率数据导入SPSSPRO在线分析平台中,以13批独一味总黄酮8个共有峰峰面积为母因素,FLS细胞活力抑制率为子因素,数据转换方式选择标准化,分辨系数取0.5,计算独一味总黄酮共有峰峰面积和FLS细胞活力抑制率的灰色关联度[19],结果见表3。

表3 共有峰峰面积与细胞活力抑制率灰色关联度分析结果

独一味总黄酮共有峰峰面积与FLS细胞活力抑制率关联度值越大,表明该成分对于独一味总黄酮发挥治疗RA的药效越重要。由表可知,8个共有峰与RA-FLS细胞活力抑制率的关联度均在0.6以上,表明独一味总黄酮抗RA活性是多种成分共同作用的结果,各共有峰对FLS细胞活力抑制率的贡献程度为4号峰>6号峰>1号峰>3号峰>5号峰>7号峰>2号峰>8号峰,其中4号峰为木犀草苷,8号峰为木犀草素。

2.3.2 偏最小二乘回归分析

以标准化处理后的8个共有峰(记为X1～X8)峰面积为自变量,标准化处理后的不同批次独一味总黄酮细胞活力抑制率为因变量,导入SIMCA 14.1作偏最小二乘回归分析(PLS)。变量投影重要性(VIP)值和偏回归系数分别见图4和5。

图4 各共有峰峰面积和细胞活力抑制率VIP值Fig.4 VIP value of common peak area and cell activity inhibition rate

图5 各共有峰峰面积和细胞活力抑制率偏回归系数Fig.5 Partial regression coefficient of common peak area and cell activity inhibition rate

由图可知,独一味总黄酮指纹图谱中峰3、4、8与FLS细胞活力抑制率呈正相关;同时VIP值越大(VIP>1),表示自变量对因变量的解释能力越强,以FLS细胞活力抑制率为指标,VIP值从大到小的峰号为峰4、7、8、5、3、2、1、6,其中峰4、7、8VIP值均大于1;根据PLS分析,4号峰和8号峰为独一味总黄酮中与FLS细胞活力抑制率关联较大的化学成分。

2.3.3 谱效关系的建立

通过建立独一味总黄酮指纹图谱,运用CCK-8法检测独一味总黄酮对RA-FLS细胞活力的影响,并结合灰色关联度分析和PLS回归分析建立了独一味总黄酮抗RA的谱效关系,揭示了独一味总黄酮中的化学成分与抗RA药效之间的关系,结果表明独一味总黄酮中的木犀草苷和木犀草素成分在其抗RA药效中发挥了主要作用。

2.4 基于成分敲除研究独一味总黄酮抗类风湿关节炎的关键成分

2.4.1 敲除样品的成分表征

目标成分、目标阴性成分和独一味总黄酮样品的HPLC色谱图见图6。

图6 敲除样品的HPLC图Fig.6 HPLC chromatogram of knockout samples注:A:木犀草苷对照品;B:目标成分样品;C:目标阴性成分样品;D:薄层制备独一味总黄酮全成分样品。Note:A:Luteoloside reference substance;B:Target component sample;C:Target negative component sample;D:Thin layer preparation of the total flavone sample of LH.

由图中可知,目标阴性成分与独一味总黄酮样品相比,木犀草苷峰面积明显降低,且除木犀草苷外其他峰均保留较好,表明该方法对独一味总黄酮中木犀草苷成分进行了有效敲除。目标成分、目标阴性成分和独一味总黄酮样品中木犀草苷的峰面积分别为:15.633 6、3.657 0和20.497 0,计算得到木犀草苷敲除率为76.27%,回收率为94.11%。

2.4.2 敲除样品的细胞药效学研究

细胞药效学实验结果见表4。统计学分析发现,与对照组比较,独一味总黄酮全成分组、目标成分组均能显著抑制FLS细胞活力(P<0.01),而目标阴性成分组与对照组之间无显著抑制效果。表明木犀草苷在独一味总黄酮发挥治疗RA药效的过程中起到了关键作用。

表4 各组样品对FLS细胞的抑制率(¯x ± s, n = 3)

2.5 等摩尔量木犀草苷和木犀草素对FLS细胞活力的影响

细胞药效学实验结果见表5。统计学分析结果显示,与对照组比较,木犀草苷组和木犀草素组均能显著抑制FLS细胞活力(P<0.01);木犀草苷组和木犀草素组比较对FLS细胞活力的影响差异无统计学意义,但木犀草素抑制率数值有明显升高趋势。

表5 木犀草苷和木犀草素对FLS细胞的抑制率(¯x ± s, n = 3)

3 讨论与结论

基于高效液相色谱-二级线性阵列检测器法(high performance liquid chromatography with diode array detector,HPLC-DAD)完成了独一味总黄酮指纹图谱的初步研究,各批次独一味总黄酮样品指纹图谱与建立的对照指纹图谱相似度均大于0.9,表明不同批次独一味总黄酮样品中含有的化学成分具有一致性。课题组前期考察了独一味总黄酮不同给药浓度和不同给药时间对FLS细胞活力的影响,基于此采用CCK-8法在64 μg/mL给药浓度处理FLS细胞48 h条件下,考察了不同批次独一味总黄酮样品对FLS细胞活力的影响,结果表明13批独一味总黄酮样品均能显著抑制FLS细胞活力。基于独一味总黄酮指纹图谱和细胞药效实验结果,采用灰色关联度和偏最小二乘(PLS)回归分析建立独一味总黄酮抗RA的谱效关系,结果表明独一味总黄酮中的木犀草苷和木犀草素成分在其抗RA药效中发挥了主要作用。基于薄层色谱法对独一味总黄酮中含量较高的木犀草苷成分进行有效敲除,并结合CCK-8法测定各样品对FLS细胞活力的影响,结果表明全成分和目标成分样品能够显著抑制FLS细胞活力,目标阴性成分样品对FLS细胞活力无显著抑制效果。同时比较了等摩尔量木犀草苷和木犀草素成分对RA-FLS细胞活力的影响,结果表明木犀草苷和木犀草素均能显著抑制FLS细胞活力,但木犀草素组与木犀草苷组之间无显著差异。

综上,本研究结果表明木犀草苷和木犀草素成分在独一味总黄酮抗RA的药效中发挥了主要作用,结合独一味总黄酮指纹图谱研究中木犀草苷的含量明显高于木犀草素,表明木犀草苷(C21H20O11)为独一味总黄酮抗RA的关键成分。能够为临床运用独一味总黄酮治疗RA提供一定的科学依据。木犀草苷广泛存在于多种药用植物中,在抗炎、抗氧化、抗癌、降血糖等方面作用明显,且毒副作用较小[20]。虽然木犀草苷成分较为常见,但目前关于木犀草苷抗RA的相关文献较为匮乏,本研究采用CCK-8法考察了木犀草苷对RA-FLS细胞活力的影响,明确说明了木犀草苷具有抑制FLS细胞活力的作用,后续可进一步通过建立大鼠关节炎模型进行体内药效验证,并对其作用通路进行阐释,为临床运用独一味总黄酮治疗RA提供更多的参考和依据。