基于网络药理学和实验验证探讨二氢杨梅素改善db/db小鼠肾纤维化的作用机制

2023-11-29刘醒然牛梦竹寇现娟

天然产物研究与开发 2023年11期

刘醒然,牛梦竹,高原,寇现娟,2*

1武汉体育学院运动医学院;2武汉体育学院运动训练监控湖北省重点实验室,武汉 430079;3广西医科大学体育与健康学院,南宁 530021

糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)主要的微血管并发症之一,也是终末期肾病的主要病因。其主要特征是肾小球基底膜的增厚、系膜和肾小管间质的基质扩张以及足细胞丢失,导致微量白蛋白尿的发展和肾功能下降[1]。随着DKD的持续发展,肾脏组织的显微结构出现持续炎症及损伤,导致弥漫性间质纤维化破坏正常肾脏显微结构,最终发展成肾纤维化(renal fibrosis,RF)。而目前缓解DKD发展成RF的手段多集中于通过改善DKD来实现。但对于包括DKD在内的多数糖尿病并发症的发生机制仍未阐明,以至于DKD演变为RF过程中的复杂机制也未清晰,导致DKD及RF的治疗效果不尽人意[2]。因此探明DKD的发病机制以及发现新的治疗靶点来抑制DKD的发展迫在眉睫。

二氢杨梅素(dihydromyricetin,DHM)是一种天然黄酮类化合物,具有多种药理作用,包括抗炎、抗氧化、清除自由基、改善线粒体功能障碍、调节自噬等[3,4]。目前多项研究表明DHM在治疗代谢性疾病方面具有巨大潜力,其不仅可以通过诱导自噬、改善氧化应激、抑制炎症、提高线粒体活性等途径改善胰岛素抵抗,降低血糖水平[5];同时对多种糖尿病并发症具有良好的改善作用,如:糖尿病脑病[6]、糖尿病心肌病[7]等。但DHM改善糖尿病并发症相关研究并不充分,相关药理机制仍需进一步探究。此外,DHM是否能够进一步改善DKD所导致的RF研究较少,治疗作用尚不明确。

网络药理学可以在庞大的生物发生过程网络背景下,基于中药成分的结构,结合其生物效应,联合疾病相关靶点进而构建“药物—成分—靶点—疾病”互作网络,是探索中药有效成分、分子机制以及潜在靶点的有效手段。分子对接可以模拟分子和蛋白质之间的相互作用,预测配体和受体的构象,对亲和力和结合模式进行计算和预测以验证药物成分对主要靶点的具体作用方式。因此,本研究采用网络药理学方式,筛选并预测DHM作用于DKD以及RF的潜在靶点,构建“成分—靶点—疾病”互作网络,结合分子对接以及体内实验对预测的主要靶点进行验证,探讨二氢杨梅素改善db/db小鼠肾纤维化的分子机制,为DHM的临床应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

6周龄SPF级雄性m/m小鼠10只,体重23±2 g,6周龄db/db小鼠20只,体重39±2 g,购买自常州卡文斯实验动物有限公司,实验动物许可证号SCXK(苏)(2016-0010)。饲养于湿度40%～55%、温度22～26 ℃,自由饮食饮水,保持良好的通风环境。实验期间均以普通饲料喂养。普通饲料均由武汉市万千佳兴生物科技有限公司提供。本实验经武汉体育学院动物实验伦理委员会批准(伦理审查批准号:0087-202010-1301)。

1.1.2 药物与试剂

二氢杨梅素(纯度98%,批号ALB-202106,美国ALB Technology Limited公司);小鼠尿微量白蛋白ELISA试剂盒(批号2M-KMLJM219762m,南京卡米洛生物工程有限公司);血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血清肌酐(serum creatinine,Scr)试剂盒(批号分别为C013-2-1、C011-2-1,南京建成生物工程研究所);Notch1、Notch胞内结构域(Notch intracellular domain,NICD)抗体(批号分别为20687-1-AP、20687-1-AP,Proteintech公司);split多毛增强子1(hairy and enhancer of split1,Hes1)和发状分裂增强子1(hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif 1,Hey1)抗体(批号分别为ab71559、ab154077,Abcam公司);第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten,PTEN)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、p-AKT抗体(批号分别为9188T、4691T、13038T,Cell Signaling Technology)。

1.1.3 仪器

DYY-6C型垂直电泳仪(北京市六一仪器厂);EPS-300型转膜仪器(海天能科技有限公司);低温高速离心机(5415R,Eppendorf);K3型酶标仪(赛默飞);超声波细胞粉碎机(JY99-IIDN,宁波新芝生物科技股份有限公司);荧光及化学放光仪(ChemiScope 6300,上海勤翔);显微镜(IXplore SpinSR,Olympus corporation);数显恒温水浴锅(HH-4,金坛市友连仪器研究所)。

1.2 方法

1.2.1 网络药理学研究

1.2.1.1 DHM作用靶点预测与疾病靶点获取

通过TCMSP(https://tcmsp-e.com/)数据库获取DHM化学结构的mol文件,并通过Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和Drugbank(https://go.drugbank.com/)数据库进行验证,验证后将所获mol文件上传至PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)数据库对DHM的作用靶点进行预测,通过uniprot(https://www.uniprot.org/)数据库对所预测靶点名称进行规范化处理。以“diabetic nephropathy”“diabetic kidney disease”“renal fibrosis”为关键词,采用DisGeNET(https://www.disgenet.org/)数据库进行检索,分别获取“DKD”“RF”的靶点。

1.2.1.2 “药物—靶点—疾病”网络的构建

将获取的DHM、DKD以及RF的靶点上传至微生信(https://www.bioinformatics.com.cn/)在线平台进行Venn图绘制并获取交集基因。而后将交集基因导入Cytoscape 3.9.1软件构建“药物—靶点—疾病”可视化互作网络。

1.2.1.3 PPI网络的构建

将交集基因导入String(https://string-db.org/)数据库进行蛋白质相互作用分析,并将分析结果导入Cytoscape 3.9.1软件,采用插件cytoHubba对分析结果进行网络拓扑参数进行分析,并以度值(degree)为参考依据选取前10位基因进行可视化处理,同时作为后期实验验证的靶基因选取依据。

1.2.1.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

采用David(https://david.ncifcrf.gov/)数据库对交集基因进行基因本体论(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析,分别筛选KEGG富集分析和GO分析中的生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、细胞成分(cellular component,CC)的前10条结果上传至微生信平台进行可视化处理。

1.2.1.5 分子对接

选取PPI网络中degree值前5位的靶基因并结合我们前期研究基础选取靶基因与DHM进行分子对接验证。通过查阅文献报道和PDB(https://www.rcsb.org/)数据库获取靶基因蛋白结构的pdb文件。采用Pymol 2.5.5软件对TCMSP数据库获取的DHM分子结构去除水分子和小分子配体,采用AutoDock Tools 1.5.6对DHM结构文件和靶基因蛋白结构文件进行加氢、定义受体和配体、分配扭转键等构象处理;采用autogrid4设置对接盒子,AutoDock4进行分子对接并获取最低结合能组合。最后使用Pymol进行结果可视化处理。

1.2.2 动物实验验证

1.2.2.1 动物分组与模型建立

实验小鼠适应性喂养1周后,将6周龄的m/m小鼠和db/db小鼠随机分为对照组(NC组)、2型糖尿病肾病组(DKD组)、DHM药物干预组(DHM组),每组各10只。NC组正常喂养不做干预,DHM药物干预组灌胃DHM(基于前期研究结果选择DHM终剂量为100 mg/(kg·d))[8,9],DKD组灌胃等体积的生理盐水,每周干预5 d,连续干预10周。

1.2.2.2 样品制备与动物处理

10周干预结束后,禁食测血糖,次日取材,摘眼球取血,分离血清用于生化指标检测,摘取双侧肾脏后,称重,取一侧肾脏于多聚甲醛固定,其余液氮冻存后转-80 ℃冰箱保存。

1.2.2.3 小鼠体重、空腹血糖和肾功能指标检测

实验期间,小鼠禁食过夜,12 h后每周固定时间测小鼠体重和空腹血糖。10周干预结束后,眼球取血,静置2 h后离心取适量血清备用。按照试剂盒提供的方法测定小鼠血清中尿素氮、肌酐、尿蛋白(urine protein,UP)表达水平。

1.2.2.4 肾脏组织病理学观察

肾脏组织于4%的多聚甲醛固定后,石蜡切片厚度约5 μm,按照乙醇脱水、透明、浸蜡、包埋,制备石蜡切片进行HE、Masson与PAS染色,观察各组小鼠肾组织病理学改变。

1.2.2.5 蛋白免疫印迹法(Western blot)

提取小鼠肾脏组织及细胞样品的总蛋白,通过BCA法测定蛋白浓度后加热变性后制备蛋白样品。经制胶、上样、电泳、PVDF转膜、5%脱脂奶粉室温封闭2 h,TBST洗膜后,加入对应的一抗,4 ℃孵育过夜,TBST洗膜,二抗室温孵育1 h,ECL发光液显影,凝胶成像分析仪摄取图像,计算目标蛋白的灰度值。

1.2.2.6 统计学方法

采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析,数据采用均数±标准差(¯x±s)表示,符合正态分布方差齐性,组间比较采用单因素方差分析;若不符合正态分布,则用非参数检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DHM改善db/db小鼠病理表现

2.1.1 DHM降低db/db小鼠体重和空腹血糖

每周定时测定各组小鼠体重和空腹血糖,结果显示与NC组相比,DKD组小鼠体重、血糖均明显升高(P<0.001、P<0.001)。与DKD组小鼠相比,DHM组小鼠的体重和血糖值下降(P<0.01、P<0.01)(见表1、表2)。

表1 DHM对db/db小鼠体重的影响(¯x ± s,n = 8)

表2 DHM对db/db小鼠空腹血糖的影响(¯x ± s,n = 8)

2.1.2 DHM改善db/db小鼠的肾功能损伤

与NC组相比,DKD组小鼠血清中肌酐、尿素氮和尿蛋白均明显升高(P<0.001、P<0.001、P<0.05)。与DKD组相比,DHM组小鼠的肌酐、尿素氮和尿蛋白均有不同程度的下降(P<0.01、P<0.001、P<0.01)(见图1)。表明DHM可以稳定db/db小鼠肾功能状态,缓解肾功能损伤。

图1 DHM对db/db小鼠血清中肌酐、尿素氮和尿蛋白的影响(¯x ± s,n = 4)Fig.1 The expression levels ofScr,BUN and UP in serum of mice in each group (¯x ± s,n = 4).注:与NC组相比,#P<0.05,###P<0.001;与DKD组相比,**P<0.01,***P<0.001。 Note:Compared with NC,#P<0.05,###P < 0.001;Compared with DKD, **P<0.01,***P<0.001.

2.1.3 DHM减轻db/db小鼠肾病理损伤

为了探究DHM干预对db/db小鼠肾脏病理损伤的影响,各组小鼠病理切片行HE染色、 PAS染色。结果如图2所示,NC组小鼠肾小球结构规则,肾小管结构清晰,肾小管上皮细胞排列整齐,且基底膜完整;DKD组小鼠肾小球体积增大,肾小球系膜细胞增生,肾间质可见肾小管肿胀且呈空泡样变性;而DHM组小鼠肾小球体积减小,肾小球系膜细胞轻度增生且基底膜增厚改善,肾间质肾小管肿胀减轻且呈空泡样变性改善,肾病理损伤程度得到改善(见图2)。

图2 DHM对db/db小鼠肾脏组织病理学的影响(× 400)Fig.2 Effects of DHM on histopathology of mouse kidney (× 400)

2.1.4 DHM改善db/db小鼠肾纤维化

为了观察DHM对db/db小鼠肾纤维化的影响,我们对肾脏组织切片行Masson和免疫荧光染色,可见与NC组相比,DKD组小鼠肾脏间质细胞外基质和肾小管胶原纤维蛋白明显增多,并且小鼠肾皮质和肾髓质中α-SMA、Fibronectin、CollagenI细胞荧光染色阳性信号显著增强、亮度较强;与DKD组比较,DHM组小鼠肾脏胶原蛋白沉积减少,并且肾脏中α-SMA、Fibronectin、CollagenI细胞荧光染色阳性信号减弱,提示DHM改善db/db小鼠肾纤维化(见图3)。

图3 DHM对db/db小鼠肾脏组织病理学的影响(× 400)Fig.3 Effects of DHM on renal pathology in db/db mice (× 400)

2.2 DHM改善db/db小鼠肾纤维化的网络药理学研究

2.2.1 DHM、DKD与RF的靶点获取与“药物—靶点—疾病”网络的构建

通过PharmMapper数据库共获取DHM相关靶点379个,分别从DisGeNET数据库获取DKD、RF相关靶点1 189、570个。将DHM、DKD和RF靶点取交集后得到37个交集靶点(见图4),并进一步导入Cytoscape软件构建“药物—靶点—疾病”网络图(见图5)。

图4 DHM、DKD与RF靶点Venn图Fig.4 Venn diagram of intersection targets of DHM,DKD and RF

图5 药物—靶点—疾病网络Fig.5 Drug-target-disease network

2.2.2 DHM、DKD与RF交集靶点相互作用的蛋白-蛋白互作PPI网络构建

将37个交集基因导入String数据库构建PPI互作网络。结果显示该网络共包含37个节点数,边数为241,平均节点度为13,聚类系数为0.768(见图6)。在Cytoscape软件中使用cytoHubba插件分析并根据度值(degree)获取前10的靶点,分别为蛋白激酶B1(protein kinase B1,AKT1)、血清中白蛋白(albumin,ALB)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cystein-asparate protease-3,CASP3)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9,MMP9)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARG)、激酶插入区受体(kinase insert domain receptor,KDR)、MMP2、血管紧张素转化酶(angiotensin I-converting enzyme,ACE)。随后将前10位基因进一步可视化(见图7)。

图6 DHM、DKD与RF靶点PPI网络图Fig.6 PPI network diagram of targets of DHM,DKD,and RF

图7 核心靶点PPI网络图Fig.7 PPI network diagram of core target protein

2.2.3 DHM、DKD与RF交集靶点的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

将37个交集基因上传至David数据库进行GO功能分析和KEGG富集分析,结果显示DHM与DKD、RF的联系涉及GO功能分析中BP 223项、CC 25项以及MF 52项。BP主要涉及凋亡的负调控与正调控、细胞对活性氧的反应以及对缺氧反应等过程(见图8);CC主要涉及胞外区、受体复合物以及细胞外空间等细胞成分(见图9);MF则主要集中在锌离子结合、酶结合和RNA聚合酶II的调节等功能(见图10)。KEGG通路富集结果显示DHM对DKD、RF的作用通路可能涉及糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGE)及其糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)信号通路、糖尿病心肌病以及叉头转录因子O亚族(forkhead transcription factor of the O class,FoxO)信号通路等(见图11)。

图8 交集靶点GO功能分析(BP)Fig.8 Intersection target GO function analysis (BP)

图9 交集靶点GO功能分析(CC)Fig.9 Intersection target GO function analysis (CC)

图10 交集靶点GO功能分析(MF)Fig.10 Intersection target GO function analysis (MF)

图11 KEGG通路富集分析Fig.11 Intersection target KEGG pathway enrichment analysis

2.2.4 DHM与靶基因蛋白分子对接结果

将DHM与PPI网络中degree值前5位的核心靶点(AKT1、ALB、CASP3、EGFR、MMP9)以及结合我们前期研究基础所选AKT1上游靶点Notch1和PTEN进行分子对接(见图12)。结果显示DHM与各靶点蛋白的结合能均小于0 kcal/mol(表3),表示DHM与所选取靶点蛋白均能良好结合,意味着DHM可以通过所对接靶点蛋白进行调控进而改善db/db小鼠DKD。

图12 DHM与核心靶点蛋白分子对接结果模式图Fig.12 Molecular docking result pattern of DHM and core target protein

表3 DHM与核心靶点蛋白分子对接结果

2.3 DHM改善db/db小鼠肾纤维化分子机制的实验验证

为进一步探讨DHM改善db/db小鼠肾纤维化的分子机制,基于网络药理学和分子对接结果,结合前期研究基础,我们对DHM干预的db/db小鼠肾脏中Notch/PTEN/AKT通路相关蛋白的变化进行研究。Western Blot结果显示,与NC组相比,DKD组小鼠肾组织中的Notch通路出现过度激活,表现为Notch1、NICD、Hes1、Hey1蛋白明显上调(P<0.05、P<0.01、P<0.001、P<0.01)并抑制PTEN的表达(P<0.01),同时促进AKT的磷酸化,即p-AKT上调(P<0.01)。而DHM干预则可逆转上述变化, DHM组Notch通路受到抑制,相关蛋白NICD、Hes1、Hey1以及p-AKT的表达均出现下降(P<0.05、P<0.01、P<0.05、P<0.01),而PTEN的表达上调(P<0.001)(见图13)。提示DHM可能通过调控Notch/PTEN/AKT通路改善db/db小鼠肾纤维化。

图13 DHM对db/db小鼠肾脏Notch/PTEN/AKT通路的影响(¯x ± s,n = 4)Fig.13 Effect of DHM on the Notch/PTEN/AKT pathway in the kidneys of db/db mice(¯x ± s,n = 4)注:与NC组相比,#P<0.05,##P<0.01,###P < 0.001;与DKD组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。Note:Compared with NC,#P<0.05,##P<0.01,###P < 0.001;Compared with DKD,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

3 讨论与结论

目前糖尿病普遍的治疗手段主要依靠血糖的控制,而作为糖尿病最严重并发症之一的DKD并无有效治疗策略[10,11]。因此深入了解DKD的发病机制以及寻找有效治疗策略来抑制DKD向肾纤维化发展的趋势非常重要。天然药物已被证实具有较少的副作用以及多靶点疗效的独特优势,是近年来研发慢性疾病新型药物的重要来源。对DHM进一步研究发现,DHM在改善代谢性疾病方面显示出巨大的治疗潜力。因此,本研究在DHM改善db/db小鼠的肾纤维化的基础上,结合网络药理学以及分子对接技术深入探讨DHM改善db/db小鼠肾纤维化的潜在治疗靶点以及分子机制,并通过动物实验验证。

首先我们观察发现10周的DHM干预可以使db/db小鼠血糖、体重、肌酐、尿素氮、尿蛋白及肾脏的病理表现出现有效缓解,意味着DHM可减轻db/db小鼠肾功能损伤,减缓DKD的发展。在对DHM、DKD以及RF的37个交集靶点分析筛选发现AKT1、ALB、CASP3、EGFR、MMP9、IGF1、PPARG、KDR、MMP2、ACE等10个靶点可能是DHM改善DKD的关键靶点。其中AKT1、CASP3、EGFR、MMP9、IGF1、MMP2、ACE已被证实在糖尿病环境中被激活,而通过特异性抑制后可改善DKD的受损状态,减缓纤维化发展的趋势[12-16]。PPARG、KDR则在糖尿病生理环境下受到抑制,激活后则起到肾脏保护作用[17]。ALB是观察DKD是糖尿病发展过程中重要的观察肾脏损伤程度的生化指标,通常表现为随着DKD的发生而升高,DKD改善后出现下降[18]。意味着我们所筛选出10个关键基因不仅可以作为DKD潜在的生物标志物,也可能是进一步探讨DKD发病机制以及治疗手段的关键靶点。

KEGG通路富集分析结果显示DHM对DKD的改善作用可能涉及AGE-RAGE信号通路、糖尿病心肌病以及FoxO信号通路。其中AGE-RAGE信号通路与FoxO信号通路在DKD发展过程中具有关键的调控作用。研究发现AGEs在DKD患者的内皮细胞、肾小管和系膜细胞以及足细胞等细胞出现特异性激活,并与RAGE相互作用增强,进一步加剧肾脏中的氧化应激和炎症,导致DKD的恶化[19]。另外,活化的FoxO3a则可以抑制糖尿病大鼠肾脏中的氧化应激水平,改善炎症,进而抑制DKD的发生[20]。表明特异性调控AGE-RAGE信号通路或FoxO信号通路可能对防治DKD具有重要意义。

分子对接结果显示DHM与所选排名前5的靶点均能表现出良好的结合性,意味着DHM治疗DKD的有效性在分子层面得到验证。此外我们注意到所筛选排名第一的关键靶基因AKT1与KEGG通路富集分析得到AGE-RAGE信号通路和FoxO信号通路在DKD发展中密切相关。其中AGE-RAGE信号通路可协同PI3K/Akt信号通路诱发肾脏内的氧化应激和慢性炎症,进而导致肾脏疾病[21]。而PI3K/Akt/FoxO3a通路的激活则可以改善糖尿病环境下肾脏的生理功能[22]。因此,我们进一步尝试探究AKT1上游的Notch通路与DHM的相互作用并进行分子对接验证。分子对接结果显示DHM与Notch1、PTEN均表现出了良好的结合性。

既往研究表明,在DKD发展过程中Notch通路出现过度激活,表现为Notch1、NICD、Hes1和Hey1的表达上升[23]。Notch1的抑制剂则可以通过降低Hes1的活化来激活PTEN,进而改善自噬障碍,减缓RF的发生[24]。此外,另有研究发现PTEN的激活也可以通过抑制PI3K/AKT通路来缓解DKD的进展[25,26]。基于以上结果,我们推测DHM可以通过调控Notch/PTEN/AKT通路改善DKD。Western blot结果显示db/db小鼠肾脏中Notch通路活化程度异常升高,PTEN表达降低以及AKT的磷酸化增加。而DHM摄入可以抑制Notch通路的活化,激活PTEN并抑制AKT的磷酸化。尽管Notch/PTEN/AKT信号轴作为整体路径在糖尿病环境下的肾脏保护作用研究较少,但我们的研究一定程度上完善了相关研究,并丰富了DHM通过多靶点发挥其生物学保护作用的分子机制。

综上所述,本研究以观察DHM改善DKD病理表现的结果为基础,结合网络药理学及分子对接技术初步论证了DHM改善DKD进展的作用可能通过AKT1、ALB、CASP3、EGFR、MMP9、IGF1、PPARG、KDR、MMP2、ACE等关键靶点来实现,并对相关通路进行了分析。最后结合动物实验对DHM潜在的AKT靶点进行了初步验证及分析,发现DHM可能通过调控Notch/PTEN/AKT通路起到防治DKD的作用(见图14)。但目前关于DHM对T2DM的并发症研究相对较少,其治疗潜力仍待进一步研究。