基于网络药理学和实验验证探讨海巴戟抗动脉粥样硬化的作用机制

张 哲,王 蓓,唐根云,饶利兵,林 玲*

1广州医科大学研究生院,广州 510000;2三亚中心医院(海南省第三人民医院),三亚 572000;3湖南医药学院,怀化 418000

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种以大、中动脉血管内膜形成粥样斑块或纤维斑块为特征的常见慢性心血管疾病[1]。动脉内膜中的脂质渗入现已成为AS的主要发病机制[2]。聚集在内膜与中膜的巨噬细胞通过细胞膜上的清道夫受体吞噬大量的低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)后形成泡沫细胞,驱动细胞释放大量的促炎因子、基质金属蛋白酶于细胞间隙,促使动脉管壁中的斑块蓄积增加,进而转为不稳定斑块,最终进展为心肌梗死[2]。然而有效延缓AS的进展一直是困扰学术界的难题之一。近年来备受欢迎的新兴药食同源之品海巴戟被证明其有良好地调节血脂,改善AS的作用[3]。

海巴戟(Morindacitrifolia),又称诺丽(Noni)为茜草科巴戟天属植物,具有抗炎、抗氧化、降脂等药理作用[4]。根据中医理论,海巴戟药味酸、甘,药性平和,有补益肾精、平补阴阳及延缓衰老之功效,可有效预防心脑血管疾病[5]。然而,海巴戟治疗AS的具体机制尚不清楚。鉴于海巴戟的化学成分复杂,其主要由蒽醌类、黄酮类、苯丙素类、酚酸类等成分组成[7],符合传统中药的多成分、多靶点的特点,因此使用网络药理学可较清楚地阐述海巴戟发挥药理作用的分子机制。近年来网络药理学是一门以计算机科学、生物信息学及数据挖掘为一体的新兴学科,它通过构建“药物-有效成分-疾病靶点-疾病”网络,并对该网络进行生物学功能解释,使人们更加清楚地认识到药物治疗疾病的机制机理[6]。本研究基于海巴戟有效成分多样,作用靶点丰富的特点,拟采用网络药理学方法,对海巴戟治疗AS的靶点、生物学过程、信号通路预测和分析,同时采用体外实验进行验证,以期为治疗AS的药物开发和治疗提供药理学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

THP-1细胞(货号:CL-0233,武汉普诺赛生命科技有限公司);海巴戟萃取粉(货号:0003S,海南西沙诺丽生物科技有限公司);胎牛血清(货号:10270-106,美国Gibco公司);RPMI1640培养基(货号:C11875500BT,美国Gibco公司);佛波酯(PMA)(货号:P1585,批号:SLCD3659,美国Sigma);油红O染色试剂盒(货号:01391,美国Sigma);人源性氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)(货号:YB-002,广州奕元生物科技有限公司);CCK-8试剂盒(货号:GK10001;GlpBio公司);22-NBD-Cholesterol(货号:GC46527,美国GlpBio公司);TRIzol(货号:ER501-01-01,北京全式金生物技术股份有限公司);cDNA逆转录试剂盒(货号:AT311-03,北京全式金生物技术股份有限公司);PPARγ、ABCA1引物(货号:007P20220307,北京擎科生物科技有限公司);抗PPARγ抗体(货号:ab178860,英国Abcam公司);抗ABCA1抗体(货号:A-7228,武汉ABclonal公司);PPARγ抑制剂GW9662(货号:A4300,美国APExBio公司)。

1.2 主要仪器

多功能酶标仪(美国BIOTeK公司);倒置相差显微镜(美国Olympus公司);倒置荧光显微镜(日本Nikon公司);低温高速冷冻离心机(美国Thermo公司);电泳仪(美国Bio-Rad公司);转膜仪(美国Bio-Rad公司);化学荧光凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司);PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3 海巴戟有效成分靶点及疾病靶点收集

在CMAUP数据库(https://www.bidd.group/CMAUP)中利用关键词“Morindacitrifolia”检索其有效成分[7]。活性成分的筛选:在CMAUP数据库的“Ingredient of the Plant”功能区中选择实验已验证的有效成分,其他未经验证的成分以化合物名称或者SMILES格式分别在TCMSP数据库(https://tcmsp-e.com/tcmsp.php)和SwissADME数据库(http://www.swissadme.ch/)中筛选。TCMSP数据库筛选标准为口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,且类药性(drug-likeness,DL)≥0.18;SwissADME数据库需满足“药代动力学”与“类药性”两个特征。通过文献检索又补充了部分活性成分[7]。

疾病靶点的获取借助“GeneCards”(https://www.genecards.org/)、“OMIM”(https://omim.org/)、“TTD”(http://db.idrblab.net/)、“PharmGKB”(https://www.pharmgkb.org/)、“DrugBank”(https://go.drugbank.com/)五个数据库,以“atherosclerosis”为关键词在各数据库中检索,其中“GeneCards”中设置筛选条件,即“score”>1。删除或合并各数据库中检索得到的重复基因。将获取的海巴戟有效成分靶点与疾病靶点取交集,导入R语言4.2.1中,使用“venn”包作图。

1.4 海巴戟治疗AS疾病蛋白互作网络(PPI)构建及核心网络筛选

将得到的交集基因导入STRING在线数据库构建PPI,下载同时生成的“.tsv”格式文件导入Cytoscape 3.7.2计算各节点的自由度并对其可视化操作,然后利用软件中“CytoNCA”插件[6]根据“介数”“接近中心性”“自由度”“特征向量”“基于局部平均连接度方法”“网络中心性”6个拓扑学参数对各个节点评分,经过筛选后得到靶点的核心网络,筛选条件为核心基因均须大于6个拓扑参数的中位数分值。

1.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

使用R语言4.2.1中“org.Hs.eg.db”“clusterProfiler”及“enrichplot”包计算交集基因的GO富集与KEGG富集条目,再使用“ggplot2包”分别作图,其中GO富集中的细胞成分(cellular component,CC)、生物学过程(biological process,BP)和分子功能(molecular function,MF)显示排名前10的条目;KEGG通路富集显示排名前20的条目。

1.6 体外实验验证

1.6.1 分组与造模

先使用100 ng/mL PMA预处理THP-1细胞48 h,然后将THP-1源性巨噬细胞分为6组:正常对照组、模型组、海巴戟低浓度组、海巴戟中浓度组、海巴戟高浓度组、海巴戟高浓度组+PPARγ抑制剂GW9662组。除正常对照组外,其余各组均需与50 μg/mL ox-LDL共孵育48 h;而海巴戟低、中、高浓度组需加入各浓度的海巴戟萃取液(海巴戟萃取粉溶于RPMI1640培养基中配成海巴戟萃取液)并与ox-LDL共孵育48 h;海巴戟高浓度组+PPARγ抑制剂GW9662组在共孵育前2 h加入10 μmol/L GW9662预处理;正常对照组使用无血清RPMI 1640培养基培养48 h。

1.6.2 CCK-8实验

取对数生长期的THP-1细胞,利用细胞计数板计数,调整细胞浓度每孔2×104个,使用100 μL含100 ng/mL PMA工作液将细胞接种于96孔板中,组别设置空白组和海巴戟8个不同浓度组(0、10、20、40、80、160、320、640 μg/mL),其中0浓度组为对照组,每组设置3个复孔。分别培养24 h、48 h后,检测前每孔加入10 μL CCK-8试剂后继续于细胞培养箱中培养2 h。然后使用多功能酶标仪检测450 nm波长的吸光值(OD值),实验重复3次。按公式(1)计算细胞存活率。

细胞存活率 =

(A实验组-A空白组) / (A对照组-A空白组) × 100%

(1)

1.6.3 油红O染色

取灭菌的细胞爬片分别放置于12孔板中,将对数生长期的细胞接种于各孔,每孔细胞的数量调整为3×105个,每组设置2个复孔。待PMA诱导48 h后,分别向各组中加入ox-LDL及不同浓度的海巴戟共孵育48 h,弃上清,PBS溶液洗3次。4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗3次,向每孔中加入1 mL的油红O工作液并于37℃烘箱避光孵育30 min,60%异丙醇分色10 s,PBS清洗3次,待自然晾干后滴加甘油封片,使用倒置荧光显微镜拍照保存。

1.6.4 22-NBD-Cholesterol细胞荧光

将处于对数生长期的各组细胞接种于96孔板中,每孔细胞数量调整为1×104个,每组设置5个复孔。待各组给药处理完成后,弃去上清,每孔加入100 μL浓度为1 μg/mL 22-NBD-Cholesterol工作液共孵育24 h,PBS洗3次,避光条件下迅速于多功能酶标仪测量荧光值和倒置荧光显微镜下拍照保存。

1.6.5 RT-PCR检测各组细胞中PPARγ、ABCA1 mRNA的表达

消化各组加药处理后的细胞,收集于离心管中,离心后取上清,PBS清洗1次,各组加入0.5～1 mL的TRIzol冰上裂解3 min,分别加入氯仿、异丙醇、无水乙醇离心分离提取总RNA,使用cDNA逆转录试剂盒逆转录成cDNA。PCR反应中模板定量为1 μg,2×Fine Taq Mix 25 μL,上游引物、下游引物各1 μL,其中引物序列见表1。PCR反应经历94 ℃预变性、94 ℃变性、56 ℃退火、72 ℃延伸、72 ℃再延伸,得到扩增后产物。配置2%琼脂糖凝胶,上样后进行DNA电泳,于凝胶成像显影仪拍照,计算mRNA的相对表达量。

表1 引物序列

1.6.6 Western blot检测各组细胞中PPARγ、ABCA1蛋白的表达

向各组加药处理后的60 mm细胞培养皿中加入裂解液100 μL并在冰上裂解30 min,收集细胞悬液后离心,取上清用BCA法检测各组蛋白的浓度后调整各组蛋白浓度一致,加入上样缓冲液后100 ℃煮沸10 min配制成样品。配置8%、10%的SDS-PAGE凝胶,电泳,转膜,5%脱脂牛奶封闭1.5 h,一抗孵育过夜(抗PPARγ抗体:1∶1 000;抗ABCA1抗体:1∶1 000),次日TBS-T洗膜3次,二抗孵育1 h,均匀滴加高敏化学发光液后显影,利用Image J软件分析目的条带与内参条带的灰度值,计算目的条带/内参蛋白的比值。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 海巴戟有效成分靶点及疾病靶点

在CAMUP数据库中得到实验验证的有效成分有17个及73个疾病靶点,TCMSP数据库、SwissADME数据库及检索文献去重后共获得有效成分42个,相关疾病靶点259个。因此海巴戟中共检索到59个有效成分(见表2),332个相关疾病靶点。分别从“GeneCards”“OMIM”“TTD”“PharmGKB”“DrugBank”数据库中检索到AS相关靶点为1 428个、2个、35个、4个和45个,去重后得到的靶点1 461个靶点。与海巴戟有效成分靶点的交集靶点为154个(见图1)。使用Cytoscape软件绘制海巴戟有效成分与交集靶点网络图,根据各节点的“degree”设置节点的颜色,“degree”越高颜色越趋于蓝色(见图2)。

图1 有效成分与疾病交集靶点Fig.1 Intersection targets of active ingredients and disease

图2 海巴戟有效成分与交集靶点网络图Fig.2 Network diagram of active ingredients of M.citrifolia and intersection targets

表2 海巴戟的有效成分

2.2 PPI构建及核心网络构建

将交集靶点导入STRING数据库中在线生成PPI图,在Cytoscape软件中对其可视化,交集靶点邻接节点个数越多,颜色愈趋于蓝色(见图3)。使用软件的插件“CytoNCA”对PPI网络的核心网络进行筛选,纳入同时大于各项拓扑参数中位数分值的靶点进行下一级分析,共完成两级核心网络创建,最后得到的核心网络中包含核心节点为28个,716条边(见表3)。筛选得到的核心靶点相邻节点越多,圆形面积越大且颜色越蓝(见图4)。值得注意的是,核心网络中含有大量与脂代谢及炎症相关的基因,如PPARG、MMP9、IL-6、CCL2等,这些均是促进AS发生发展的直接关联基因。

图3 海巴戟治疗AS的蛋白互作网络(PPI)Fig.3 PPI network of M.citrifolia in the treatment of AS

图4 核心网络拓扑图Fig.4 Network topograph for the core network

表3 核心网络节点拓扑参数

2.3 GO富集分析与KEGG富集分析

GO功能富集分析得到2 844个条目,KEGG通路富集分析得到182个条目。以P<0.05为条目的筛选条件,富集得到GO的功能主要包括细胞膜受体、核受体等生物学功能(见图5A)。KEGG富集通路主要包括脂质与动脉粥样硬化、PPAR信号通路等,这些生物学过程均与海巴戟调节脂质异常密切相关,其中过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome transcriptional proliferator-activated receptors,PPAR)信号通路可能在其中发挥着重要作用(见图5B)。

图5 海巴戟调节AS靶点的GO分析(A)和KEGG富集分析(B)Fig.5 GO function enrichment analysis (A) and KEGG pathway analysis (B) for AS by M.citrifolia

2.4 体外实验

2.4.1 不同浓度的海巴戟对THP-1源性巨噬细胞活性的影响

CCK-8结果显示,不同浓度(0～640 μg/mL)的海巴戟在24 h及48 h对细胞活性的影响,在浓度为320、640 μg/mL时,相比于对照组,海巴戟对THP-1源性巨噬细胞的毒性作用显著增加(P<0.05)(见图6)。海巴戟浓度在0～160 μg/mL对细胞毒性的作用较小,因此本研究分别选择10、20、40 μg/mL作为海巴戟低、中、高浓度组。

图6 不同浓度的海巴戟对THP-1源性巨噬细胞活性的影响Fig.6 Effect of different concentrations of M.citrifolia on the activity of THP-1-derived macrophages注:在24 h组中,与对照组比较,##P<0.01;在48 h组中,与对照组比较,**P<0.01。Note:In the 24 h group,compared with control group,##P<0.01;In the 48 h group,compared with control group,**P<0.01.

2.4.2 海巴戟促进THP-1源性巨噬细胞胆固醇流出

结果如图7、表4所示,与对照组比较,模型组的脂滴含量与荧光强度显著升高(P<0.05);与模型组比较,海巴戟各浓度组的脂滴含量明显降低,而荧光强度在中、高浓度组显著降低(P<0.05)。

图7 海巴戟干预后对THP-1源性巨噬细胞胆固醇流出的影响Fig.7 The effect of M.citrifolia on cholesterol efflux from THP-1-derived macrophages注:A.正常对照组;B.模型组;C.海巴戟低浓度组;D.海巴戟中浓度组;E.海巴戟高浓度组(下同)。I:油红O实验(×200);II:22-NBD-Cholesterol细胞荧光(×200)。Note:A.Control group;B.Model group;C.M.citrifolia low dose group;D.M.citrifolia medium dose group;E.M.citrifolia high dose group (the same below);I:Oil red O staining (×200);II:22-NBD-Cholesterol fluorescence (×200).

表4 海巴戟干预后对THP-1源性巨噬细胞胆固醇流出量的影响

2.4.3 海巴戟对THP-1源性巨噬细胞中PPARγ、ABCA1 mRNA及蛋白表达的影响

结果如图8所示,与对照组比较,模型组PPARγ、ABCA1 mRNA表达显著降低(均P<0.05);与模型组比较,各浓度海巴戟组的PPARγ、ABCA1 mRNA的表达呈剂量依赖性增加(均P<0.05)。如图9所示,与对照组比较,模型组PPARγ、ABCA1蛋白表达显著降低(均P<0.05);与模型组比较,各浓度海巴戟组的PPARγ、ABCA1 蛋白表达呈剂量依赖性增加(均P<0.05)。

图8 海巴戟对THP-1源性巨噬细胞PPARγ、ABCA1 mRNA表达的影响Fig.8 Effect of M.citrifolia on the mRNA expression of PPARγ and ABCA1 in THP-1-derived macrophages注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;与对照组比较,#P<0.05(下同)。Note:Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with the control group,#P<0.05(the same below).

图9 海巴戟对THP-1源性巨噬细胞中PPARγ、ABCA1 蛋白的表达的影响Fig.9 Effect of M.citrifolia on the expression of PPARγ and ABCA1 proteins in THP-1-derived macrophages

2.4.4 海巴戟对GW9662预处理THP-1源性巨噬细胞后胆固醇流出的影响

结果如图10所示,与海巴戟高浓度组比较,海巴戟高浓度组+GW9662可显著增加细胞内脂滴含量与荧光强度。结果如图11和图12所示,与海巴戟高浓度组比较,海巴戟高浓度组+GW9662可显著降低THP-1源性巨噬细胞PPARγ、ABCA1 mRNA的表达(均P<0.05);与海巴戟高浓度组比较,海巴戟高浓度组+GW9662可显著降低THP-1源性巨噬细胞PPARγ、ABCA1蛋白的表达(均P<0.05)。

图10 海巴戟对GW9662预处理THP-1源性巨噬细胞后胆固醇流出的影响Fig.10 The effect of M.citrifolia on cholesterol efflux from THP-1-derived macrophages pretreated with GW9662注:A.正常对照组;B.模型组;C.海巴戟高浓度组;D.海巴戟高浓度+GW9662(下同)。I:油红O实验(×200);II:22-NBD-Cholesterol细胞荧光(×200)。Note:A.Control group;B.Model group;C.M.citrifolia high dose group;D.M.citrifolia high dose + GW9662 group(the same below).I:Oil red O staining (× 200);II:22-NBD-Cholesterol fluorescence (× 200).

图11 海巴戟对GW9662预处理THP-1源性巨噬细胞后PPARγ、ABCA1 mRNA表达的影响Fig.11 Effect of M.citrifolia on the expression of PPARγ and ABCA1 mRNA in THP-1-derived macrophages pretreated with GW9662注:与海巴戟高浓度组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05(下同)。Note:Compared with M.citrifolia high dose group,*P<0.05;Compared with the model group,#P<0.05(the same below).

图12 海巴戟对GW9662预处理THP-1源性巨噬细胞后PPARγ、ABCA1蛋白表达的影响Fig.12 The effect of M.citrifolia on the expression of PPARγ and ABCA1 proteins in THP-1-derived macrophages pretreated with GW9662

3 讨论与结论

AS是一种常见的心血管疾病,其快速进展可直接促使患者发生恶性心血管事件,如心肌梗死等[1]。现代医学认为脂质学说仍是AS发生的主要机制[2]。临床上常使用他汀类、PCSK9抑制剂等降脂药物来延缓AS的进展,但因这些药物在治疗剂量下仍出现如肌肉酸痛、肝功能损害等不良反应,使得许多患者不能耐受[8]。因此寻找新型、更安全、低毒的药物治疗AS具有积极意义。海巴戟作为新兴药食同源之品,具有广泛的活性成分与药理作用,符合传统中药多靶点、多途径治疗疾病的典型特点。本研究利用网络药理学预测海巴戟治疗AS的有效成分及作用靶点,并构建了THP-1源性巨噬细胞模型验证海巴戟通过PPARγ信号通路促进细胞内胆固醇的流出。

通过多种数据库对海巴戟的有效成分进行筛选,发现黄酮类、苯丙素类及酚酸类等59个化合物主要发挥着治疗AS的作用。近年来多项研究报道[9],黄酮类化合物在治疗AS中扮演着关键角色,是植物药的主要活性部位。Sahib等[10]研究发现海巴戟果实中儿茶酸、槲皮素与山柰酚的含量分别为53.68 mg/g、7.4 mg/g、6.4 mg/g,在已知有活性的黄酮类化合物中排名前三位,而这三种成分在调节血脂异常与延缓AS中作用显著。研究发现[11],益心通脉颗粒主要成分儿茶酸通过分子对接和体内外实验均证实其能直接激活PPARγ通路从而改善AS。槲皮素广泛存在于多种植物中,而在海巴戟中含量占比显著,Jia等[12]和Li等[13]均报道槲皮素可明显减少高脂饮食诱导ApoE-/-小鼠AS模型胸主动脉斑块含量,其机制与ATP结合盒转运蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)表达增加有关。研究证实[14],山柰酚具有较强抗炎活性,能通过激活PI3K/AKT/Nrf2通路延缓AS进展。

随后在GO富集分析中发现,海巴戟主要调节细胞的膜受体以及核受体等生物学功能;KEGG信号通路富集分析发现海巴戟治疗AS与脂代谢相关信号通路有关,而PPAR信号通路位列其中。研究表明[15],脂代谢相关信号通路尤其是PPAR信号通路与细胞膜的脂质转运体及细胞核内受体关系密切。众所周知,PPARs是位于细胞核内一类经典的核受体,在接受到第二信使的信号后,通过激活下游转录因子,增加细胞膜上胆固醇转运体的表达,进而减少细胞内胆固醇的聚集,阻碍巨噬细胞演变为泡沫细胞[16]。因此PPAR信号通路在减少脂核中泡沫细胞的形成及延缓AS扮演着重要的角色。此外,在本研究中PPARG基因亦是成分靶点网络中核心网络的重要节点。

基于上述网络药理学分析,本研究在体外实验构建THP-1源性巨噬细胞模拟粥样斑块中泡沫细胞[12],海巴戟干预THP-1源性巨噬细胞后发现,细胞内胆固醇含量明显减少,并且细胞内PPARγ的表达显著上调。Inada等[17]、Nerurkar等[18]分别通过动物实验明确海巴戟的降脂作用。在一项临床研究中发现[19],海巴戟可显著降低重度吸烟受试者血清中LDL含量,并升高其高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)的水平。最近Chong等[3]证实海巴戟可使热氧化棕榈油饮食诱导的AS大鼠模型主动脉中脂质斑块明显减少,但具体机制尚未阐明。早前,Lee等[20]使用70%甲醇萃取海巴戟果实干粉,发现其在C2C12骨骼肌细胞中能激动PPARγ受体,该实验报道与我们结果一致。本研究首次发现海巴戟能促进THP-1源性巨噬细胞胆固醇流出,并结合网络药理学预测其通过激活PPARγ信号通路发挥胆固醇逆转运(reverse cholesterol transport,RCT)作用。RCT系体内调节脂质异常和改善AS重要机制之一,可将细胞中的胆固醇经细胞膜上的清道夫受体转出细胞,随后与血浆中的载脂蛋白apoA、apoE等结合后运输至肝脏代谢,并转化为胆汁酸排出体外,从而改善脂代谢异常[21]。而ABCA1作为巨噬细胞膜上重要的清道夫受体,受上游核转录因子PPARγ的精细调控,通过RCT过程负责将细胞内胆固醇转运至细胞外[16]。本研究中ABCA1的表达水平随PPARγ的激活而上调,当使用PPARγ抑制剂GW9662时,THP-1源性巨噬细胞中ABCA1受体表达升高趋势受到抑制,同时细胞内胆固醇含量无明显下降,表明PPARγ介导的ABCA1是细胞内胆固醇转运的主要载体。类似地,槲皮素[12]、黄芩苷[22]和二氢杨梅素[23]均可通过激活PPARγ/ABCA1信号通路,促进RCT,发挥抗AS的作用。因此,海巴戟能通过激活PPARγ信号通路促进THP-1源性巨噬细胞的胆固醇流出。

综上,海巴戟药味甘、酸,药性平和,可补益肾精、平补阴阳,预防心脑血管疾病。本研究利用网络药理学结合体外实验揭示了海巴戟治疗AS的机制,首次证明海巴戟能促进THP-1源性巨噬细胞胆固醇流出,并通过激活PPARγ信号通路促进RCT。因此本研究为海巴戟有效防治AS提供新的药理作用机制。然而本研究仍存在一些局限:(1)由于TCMSP数据库未纳入植物药海巴戟,因此借助CAMUP数据库和SwissADME数据库辅助筛选其活性成分。虽然有研究[24]亦借助多种数据库联合筛选中药成分,但不同数据库活性成分的筛选标准不同,所以在筛选可靠性方面有待进一步验证;(2)本研究筛选了5种疾病相关数据库,结果显示各数据库中AS靶点数目差异较大,可能与每种数据库收录的病种存在差异有关;(3)本课题组将在体外实验结果基础上,进一步构建AS动物模型,从体内实验角度为海巴戟促进RCT延缓AS提供更加完整的实验依据。